ФЕРМЕНТИ

ФЕРМЕНТИ (Латинський fermentum бродіння, бродильне початок; синонім ензими) - специфічні білки, здатні у багато разів прискорювати хімічні реакції, що протікають в живих організмах, не входячи при цьому до складу кінцевих продуктів реакції, тобто є біологічними каталізаторами.

Всі хімічні реакції, що відбуваються в мікроорганізмах, рослинних і тваринних організмах, каталізуються відповідними ферментами.

Перетравлення, всмоктування та засвоєння харчових речовин, синтез і розпад білків, нуклеїнових кислот, жирів, вуглеводів та інших сполук у тканинах і клітинах будь-якого організму являють собою сукупність ферментативних реакцій. Будь-який функціональний прояв живого організму - дихання, м'язове скорочення, нервово-психічна діяльність, розмноження та ін. - Забезпечуються дією відповідних ферментних систем.

Ферменти мають особливі властивості, що відрізняють їх від неорганічних каталізаторів (див.): високою субстратною специфічністю і здатністю прискорювати реакції у фізіологічних умовах, тобто умовах, характерних для життєдіяльності клітин (відповідна температура, реакція середовища та ін.).

• 1 Історія
• 2 Хімічна природа та будова ферментів
• 3 Ізоферменти
• 4 Механізм дії ферментів та їх специфічність
• 5 Кінетика ферментативних реакцій
• 6 Класифікація та номенклатура ферментів
• 7 Одиниці активності ферментів
• 8 Локалізація ферментів у клітині
• 9 Розподіл ферментів в органах та тканинах
• 10 Внутрішньоклітинна регуляція ферментативної активності
• 11 Ферменти та клінічна медицина
• 12 Гістохімічні методи визначення ферментів у тканинах
• 13 Ферменти у судово-медичному відношенні

Історія

Термін «фермент» був запропонований на початку 17 століття голландським натуралістом П. Ван-Гельмонтом, який назвав так невідомий агент, який активно бере участь у процесі спиртового бродіння. Перше наукове уявлення про ферменти було висловлено в 1814 році, коли російський учений К. С. опублікував результати експериментів, які показали, що не тільки пророслі зерна ячменю (солод), але й екстракти з них здатні перетворювати крохмаль на мальтозу ("осахаривать" його). активну речовину, що міститься в екстрактах з пророслих зерен ячменю, і отримали його у вигляді порошку, який втрачав свою активність під час нагрівання. Вони назвали цю речовину діастазою (див. Амілази).

У середині 19 століття розгорілася дискусія між Л. Пастером і Ю. Лібіхом про природу бродіння (див.). . К). Лібіх та його прихильники вважали, що бродіння є. суто хім. процесом, роль каталізаторів у якому грають розчинні ферменти. .Манасеїна, розтираючи дріжджі з подрібненим гірським кришталем і потім досліджуючи процес бродіння, що індукується цим гомогенатом, дійшла висновку, що для алкогольного бродіння наявність живої дріжджової клітини не є обов'язковою. 1897 року Еге. Бухнер отримав безклітинний дріжджовий сік, який також викликав спиртове бродіння. Стало очевидним, що дріжджовий сік та дріжджовий гомогенат містять ферменти, необхідні для здійснення процесу бродіння, і що ці ферменти можуть функціонувати, перебуваючи як у клітинах, так і поза ними.

На початку 20 століття були отримані дані, що свідчать, що ферменти є білками. Важливим етапом у розвитку вчення про ферменти з'явилися дослідження американських біохіміків Самнера (J. В. Sumner), який виділив у 1926 році в кристалічному вигляді фермент уреазу (див.) з насіння канавалії, і Нортропа (J. Н. Northrop), який отримав у 1930 Цього року кристали протеолітичного ферменту пепсину (див.). Цими роботами білкова природа ферментів була доведена незаперечно.

До початку 80-х років 20 століття науці стало відомо вже понад 2 тисячі ферментів, з яких близько 500 отримано в кристалічному стані. Майже половина зареєстрованих ферментів виділено у практично чистому індивідуальному стані.

Хімічна природа та будова ферментів

Усі ферменти - білки, що мають, як і інші білки, первинну, вторинну, третинну і часто четвертинну структуру (див. Білки). Ферменти можуть бути як простими, і складними білками. Молекули ферментів, що являють собою прості білки, повністю побудовані з поліпептидних ланцюгів і при гідроліз розпадаються тільки на амінокислоти.Прикладом таких ферментів є гідролітичні ферменти пепсин, трипсин (див.), уреаза, лізоцим (див.) та ін. Більшість природних ферментів відноситься до складних білків, що містять у складі своєї молекули крім поліієптидних ланцюгів небілковий компонент. Як білкова частина такого складного ферменту (апо-фермент), і небілковий компонент його молекули (кофермент) окремо позбавлені ферментативної активності. Тільки з'єднавшись разом та утворивши так званий. холо-фермент, вони набувають властивостей, характерних для біокаталізаторів.

Ряд коферментів є похідними вітамінів. За хімічною будовою багато коферментів є нуклеотидами, деякі — органічні похідні фосфорної кислоти або пептиди та їх похідні (наприклад, фолієва кислота, Ко А, глутатіон та ін.). Таким чином, між ферментами, вітамінами та нуклеотидами існує певний функціональний зв'язок.

Ізоферменти

З відомих до початку 80-х років 20 століття ферментів у тканинах людини понад 100 мають ізоферменти (див.), Що являють собою молекулярні різновиди ферментів. Ізоферменти каталізують ту ж реакцію, але відрізняються за фізико-хімічними властивостями: електрофоретичної рухливості, адсорбційним властивостям, оптимальним значенням pH, термостабільності, чутливості до інгібіторів. , спорідненості до субстратів, здатності утворювати комплекси з аналогами коферментів та ін.

Генетично детерміновані та негенетичні (вторинні, або набуті) ізоферменти називають множинними формами ферментів. Генетично детермінованими, наприклад, є ізоферменти лактатдегідрогенази (див.).Більшість органів і тканин людини містить п'ять ізоферментів лактатдегідрогенази (ЛДГ), молекули яких є різними комбінаціями поліпептидних ланцюгів двох типів — Н і М, біосинтез цих поліпептидів контролюється різними генами. Негенетичні ізоферменти можуть виникати, як вважається, внаслідок хімічної модифікації вихідного ферменту чи його часткового протеолізу. Прикладом такої модифікації може бути утворення ізоформ піруваткінази (КФ 2.7.1. 40), що відрізняються за фізико-хімічними та імунохімічними властивостями (див. Кінази), в результаті дії на цей фермент протеїназ (див. Пептид-гідролази). Одна з цих форм виявлена ​​тільки в еритроцитах, а інша - у печінці, нирках, скелетних м'язах, міокарді та лейкоцитах.

Обидві групи ізоферментів відіграють важливу роль у регуляції клітинного метаболізму, а наявність ізо-ферментних спектрів, специфічних для різних органів та тканин, використовується в медицині з діагностичною метою.

Механізм дії ферментів та їх специфічність

Для пояснення механізму дії ферментів було запропоновано багато теорій. Всі вони виходять з експериментально встановленого факту, що біокаталізатори, як і неорганічні каталізатори, не можуть уможливити перебіг процесів або реакцій, які з точки зору законів термодинаміки (див.) неможливі. Всі теорії каталізу (див.) допускають, що каталізатори тим чи іншим шляхом знижують енергію активації реакції, що каталізується, і таким чином різко збільшують швидкість хімічного перетворення. Каталізатори лише скорочують час, необхідний досягнення хімічних реакцій (див. Хімічні реакції) стану рухомого рівноваги.Стан рухомого рівноваги оборотної хімічної реакції в присутності каталізатора стає стаціонарним.

Початок сучасним уявленням про механізм дії ферментів було покладено роботою Міхаеліса (L. Michaelis) та Ментен (М. L. Menten), опублікованою в 1913 році. потім розпадається з утворенням продуктів ферментативної реакції та звільненням ферментів у вихідному стані.

У процесі утворення та перетвореннях фермент-субстратних комплексів прийнято розрізняти кілька стадій: 1) приєднання молекули субстрату до ферменту;

Специфічність, яку виявляють ферменти щодо субстрату як при утворенні фермент-субстратного комплексу, так і при каталітичному хімічному перетворенні, обумовлена ​​існуванням у молекулі ферменту специфічної ділянки, що називається активним центром, яка бере безпосередню участь у каталітичній дії, отримала назву каталітичної ділянки, а місце, де здійснюється зв'язування ферменту з субстратом - контактного ділянки, або контактного майданчика. До 80-х років 20 століття було ідентифіковано амінокислотний склад активних центрів багатьох ферментів.В активний центр ферменту можуть входити амінокислотні залишки, порівняно далеко віддалені один від одного в поліпептидному ланцюгу і зблизилися в результаті її «перекручування» при утворенні вторинної та третинної структур ферментного білка. Так, в молекулі хімотрипсину (див.) До складу активного центру входять залишок гістидину, що знаходиться в поліпептидного ланцюга в положенні 57, залишок серину в положенні 195 і залишок аспарагінової кислоти в положенні 102.

Розташування амінокислотних залишків, що формують контактну ділянку в молекулі ферменту, сприяє такому просторовому розміщенню субстрату, яке є найбільш сприятливим для його атаки каталітичними (функціональними) групами активного центру. Напр., реакція А + В -> АВ, що каталізується сполуками, що мають активні групи С, D і Е, у звичайних умовах мала б відбуватися тільки в тому випадку, якби одночасно зіткнулися всі п'ять реагентів. Імовірність такого зіткнення дуже мала, тому швидкість утворення продукту реакції АВ у цьому випадку практично дорівнює нулю. У тому випадку, якщо цю реакцію каталізує фермент, потрібна лише його взаємодія з речовинами А та В, оскільки групи С, D та Е вже «вмонтовані» у молекулу ферменту. Внаслідок ефекту близькості реакційних груп у молекулі швидкість каталізованої ферментом реакції збільшується на кілька порядків. Крім того, коли субстрат приєднується до активного центру ферменту, просторова конфігурація молекули субстрату змінюється і певні хім. зв'язки у ній слабшають.

Каталітична активність ферменту визначається структурою його молекули загалом.Інші амінокислотні залишки, крім тих, що входять до активного центру, необхідні для формування та стабілізації певної конформації активного центру (див. Конформація), вони також утворюють ділянки, з якими специфічно взаємодіють різні речовини, що регулюють активність ферменту. У молекулі ферменту є такі ділянки, за рахунок яких він може взаємодіяти з іншими ферментами (утворення мультиферментних комплексів) або білками мембран (мембранні ферменти).

Найважливішим властивістю ферментів є їх субстратна специфічність, тобто здатність як прискорювати реакції, а й вибірково каталізувати лише певний шлях перетворення конкретної речовини — субстрату. За ознакою специфічності дії всі ферменти можна розділити на дві групи: ферменти, що мають абсолютну специфічність, і ферменти, що мають відносну специфічність. Абсолютна специфічність проявляється тоді, коли ферменти діє лише одне єдине речовина і каталізує лише певне перетворення цієї речовини. Наприклад, уреаза каталізує тільки одну реакцію - гідроліз сечовини (див.), тобто її розщеплення на аміак NH3 і діоксид вуглецю CO₂. До абсолютної специфічності відносять також стереохімічну (оптичну) специфічність (див. Ізомерія). У живій природі зустрічаються лише певні просторові форми сполук: амінокислоти (див.) – у білках лише L-ряду, цукру – переважно D-ряду. Ферменти завжди діють лише на один із двох оптичних ізомерів речовини (L- або D-ізомер). Наприклад, ЛДГ каталізує окислення лише L-лактату. Специфіка ферменту може бути спрямована і на інші типи стереоізомерів.Так, ферменти, що діють на транс-ізомер, зазвичай неактивні щодо цис-ізомеру цієї ж речовини.

Поряд з ферментами, яким властива абсолютна специфічність, є велика група ферментів, що мають відносну або групову специфічність. Наприклад, пепсин каталізує розщеплення білкових молекул, які можуть істотно відрізнятися один від одного як за амінокислотним складом, так і за фізико-хімічними властивостями. Пояснюється це тим, що місцем дії пепсину є пептидна зв'язок -СО-NH -. Відносну специфічність мають також естерази (див.). Для їхньої дії важлива наявність у молекулі субстрату складноефірного зв'язку. Однак існують естерази, що діють більш вибірково. Так, для фосфатаз важливо, щоб в утворенні складного ефіру брала участь ортофосфорна кислота (див. Фосфорні кислоти).

Кінетика ферментативних реакцій

Швидкість ферментативної реакції залежить насамперед від природи ферменту, який може мати низьку або високу ферментативну активність, а також від концентрації субстрату, величини pH середовища, температури, присутності інгібіторів або активаторів та ін. (див. Кінетика біологічних процесів). Встановлено, що за інших рівних умов та за наявності надлишку субстрату початкова швидкість ферментативної реакції пропорційна концентрації ферменту.

Мал. Графік, що виражає залежність між швидкістю ферментативної реакції (v) і концентрацією субстрату (S) при постійній концентрації ферменту: від різання абсциси Км відповідає константі Міхаеліса (концентрації субстрату, при якій швидкість даної ферментативної реакції становить половину від максимальної - Vмакс).

Залежність між концентрацією субстрату та швидкістю ферментативної реакції графічно можна виразити кривою, показаною на малюнку. Швидкість реакції, що відповідає висхідній частині кривої, пропорційна концентрації субстрату (S); у верхній частині кривої швидкість реакції наближається до максимального значення (v_Макс) і майже залежить від концентрації субстрату. Виходячи з уявлень про утворення фермент-субстратних комплексів у ході ферментативної реакції, Міхаеліс і Ментен розрахували дуже важливу константу, пізніше названу константою Міхаеліса (Км), яка в числовому вираженні дорівнює тій концентрації субстрату (моль/л), при якій швидкість реакції становить половину максимальної (тобто коли у будь-який момент у комплексі із субстратом знаходиться половина молекул ферменту). Таким чином, Км є мірою спорідненості між ферментом та субстратом, причому низькі величини Км свідчать про високий ступінь такої спорідненості.

Існує ще одна величина, що характеризує ферментативну реакцію, яка отримала назву «кількість оборотів ферменту». Величина ця показує, скільки молекул субстрату перетворюється на продукти реакції за одиницю часу для однієї молекулу ферменту.

Ферментативні реакції, подібно до звичайних хімічних реакцій, прискорюються при підвищенні температури. Встановлено, що підвищення температури на кожні 10 ° збільшує швидкість ферментативної реакції в 1,5 - 2 рази (така закономірність для більшості ферментів проявляється в інтервалі від 10 до 30 °). Показано також, що підвищення температури на 1° підвищує активність ферменту на 4-10%. Однак при температурі 50° та вище відбувається поступове зниження активності ферменту.Подальше нагрівання (до 60-70 °) призводить до поступової денатурації та інактивації ферменту. Ступінь інактивації залежить також від тривалості температурного впливу.

Ферменти дуже чутливі до змін рН середовища. Кожен фермент має оптимум pH, при якому він найбільш активний. Більшість ферментів оптимальна величина pH близька до нейтральної (pH 7,0). Таким чином, максимальна активність ферменту проявляється при фізіологічних значеннях pH, а в кислому та лужному середовищі їх активність знижується. З цього правила, втім, є винятки. Наприклад, пепсин, що міститься в шлунковому соку (див.), активний лише в дуже кислому середовищі (pH близько 2,0), а трипсин при цих значеннях pH повністю інгібується. Оптимум дії трипсину лежить при pH близько 8,0, тобто у лужному середовищі.

Крім температури, величини pH середовища, концентрації субстрату велике впливом геть активність ферменту надає присутність низки хім. з'єднань. Одні їх підвищують активність ферменту, інші, навпаки, пригнічують її. Іноді, втім, сполуки, що є інгібіторами для одних ферментів, можуть бути активаторами для інших (найчастіше це стосується іонів металів). Процес інгібування ферменту може бути оборотним і необоротним. Розрізняють також конкурентне та неконкурентне інгібування ферментативних реакцій. Конкурентне інгібування виникає тоді, коли в середовищі одночасно присутні субстрат і подібний до нього за структурою інгібітор (структурний аналог субстрату). У цьому випадку субстрат та інгібітор конкурують за активний центр ферменту. Гальмуюча дія конкурентного інгібітора на фермент залежить від концентрації субстрату.Якщо серед ферменту перебуває багато молекул субстрату і мало молекул інгібітору, то у взаємодію Космосу з активним центром ферменту значно частіше вступає субстрат. І тут ферментативна реакція не припиняється, лише уповільнюється. Якщо в інкубаційному середовищі створити надлишок субстрату, конкурентне інгібування припиняється. У разі неконкурентного гальмування інгібітор не має структурної схожості із субстратом. Тому підвищення концентрації субстрату не може призвести до витіснення інгібітора з комплексу фермент-інгібітор, як це відбувається при конкурентному гальмуванні. Прикладом неконкурентного гальмування може бути дія ціаністих сполук на цитохромоксидазу (див. Цитохроми).

Поряд із інгібіторами ферменту існують також їх активатори. Дуже часто роль активаторів виконують іони металів. Нерідко дія іону металу як активатор полягає у зв'язуванні субстрату з ферментом. У ряді випадків дія іонів металів є абсолютно специфічною, тобто для активації даного ферменту потрібна наявність певного іона. Однак є ферменти, здатні однаковою мірою активуватися одними і тими ж іонами металів. Іон металу може бути постійним компонентом активного центру ферменту. Такі ферменти одержали назву справжніх металоферментів (див. Металопротеїди). В інших випадках іон металу не пов'язаний постійно з ферментом і може функціонувати лише як місток між ферментом та субстратом. У цьому випадку утворення фермент-субстратного комплексу йде ступенеподібно. Найчастіше спочатку іон металу з'єднується з ферментом, а потім уже виникає комплекс фермент-метал-субстрат.

Як активатори ферменти можуть виступати також цистеїн (див.), відновлений глутатіон (див.), мер-каптоетанол та інші речовини, що містять вільні SH-групи (див. Сульфгідрильні групи). Активуючий ефект подібних сполук полягає в тому, що вони відновлюють дисульфідні зв'язки (S-S-зв'язку) неактивного ферменту з утворенням вільних SH-груп, які необхідні ферментам для прояву його каталітичної активності.

Іншим прикладом активації є перетворення неактивних попередників ферментів (проферментів, чи зимогенів) на активні ферменти. В цьому випадку в основі активації лежить гідроліз одного або кількох пептидних зв'язків у молекулі проферменту під дією протеолітичних ферментів. Так, до складу поліпептидного ланцюга проферменту трипсину-трипсиногену входять 229 амінокислотних залишків. В результаті гідролізу пептидного зв'язку між 6-м і 7-м амінокислотними залишками від поліпептидного ланцюга трипсиногену відщеплюється N-кінцевий гексапептид, після чого створюються умови для формування активного центру трипсину.

Класифікація та номенклатура ферментів

Згідно з сучасною класифікацією, розробленою Міжнародною комісією з ферментів Міжнародної біохімічної спілки та затвердженою на засіданні Генеральної асамблеї Міжнародної біохімічної спілки в 1961 році в Москві, кожен фермент, включений до класифікації, має шифр, що складається з чотирьох чисел, розділених крапками. Перше число визначає клас, друге – вказує підклас, третє – підпідклас, четверте – порядковий номер ферменту в межах підпідкласу.Усі ферменти на кшталт катализируемой реакції поділяються на шість класів: оксидоредуктази (див.), трансферази (див.), гідролази (див.), ліази, ізомерази (див.), лігази (синтетази). Оксидоредуктази каталізують окислювально-відновлювальні реакції (див.); трансферази - реакції перенесення хімічних груп (див. Переметилювання, Пересульфідування, Перефосфорилування, Трансамінування); гідролази - реакції гідролізу (див.) субстратів; ліази - реакції відщеплення хім. груп негідролітичним шляхом; ізомерази - реакції ізомеризації різного типу; лігази (синтетази) - реакції синтезу, пов'язані з розщепленням АТФ або його аналогів. Класи ферментів, своєю чергою, поділяються певну кількість підкласів, які поділяються на підпідкласи. Назва та номер підкласу характеризують хім. природу субстрату і тієї групи атомів у його молекулі, яка змінюється під дією відповідного ферменту, назва та номер підпідкласу, як правило, уточнюють хімічну природу цієї групи атомів у молекулі субстрату. У ліаз, наприклад, назва і номер підпідкласу уточнюють тип групи, що відщеплюється, у гідролаз — тип гідролізованого зв'язку, а у оксидоредуктаз — природу другого субстрату.

Міжнародний біохімічний союз прийняв дві номенклатури ферментів: систематичну та тривіальну (робочу). Систематична назва складається із двох частин. Перша частина являє собою назву субстрату (субстратів), друга частина із закінченням «-аза» вказує на реакцію, що каталізується ферментом. Як тривіальні назви ферменту в більшості випадків збережені загальноприйняті традиційні назви.Наприклад, фермент, що розщеплює гідролітичним шляхом сечовину на аміак та діоксид вуглецю (вуглекислий газ), відноситься до класу гідролаз. Його шифр – КФ 3.5.1.5, систематична назва – «сечовина – амідогідролаза», тривіальна назва – «уреаза».

Одиниці активності ферментів

Визначення кількісного вмісту ферменту в біологічних об'єктах є відомими труднощами, оскільки за рідкісним винятком ферментів у тканинах присутні в мізерно малих концентраціях. Тому безпосередньо визначають не концентрацію ферменту, яке активність. Про активність ферменту судять за швидкістю ферментативної реакції, тобто за швидкістю втрат субстрату або за швидкістю утворення продуктів реакції.

Міжнародна біохімічна спілка рекомендувала міжнародну одиницю активності ферменту (ME). Одна міжнародна одиниця відповідає тій кількості ферменту, який каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв. в оптимальних при цьому ферменту умовах. Проте ME може вважатися одиницею системи СІ, оскільки хвилина є позасистемної одиницею.

Одиницею активності ферментів СІ є катал (кат) та її похідні (мкат та інших.). Один катал - це кількість ферменту, яка необхідна для каталітичного перетворення одного моля субстрату за 1 сек. Активність ферменту в сироватці крові відповідно до системи СІ виявляється у каталах та її частках на літр.

Локалізація ферментів у клітині

Майже всі ферменти функціонують усередині тих клітин, у яких відбувається їхній біосинтез. Виняток становлять ферменти травного тракту, а також деякі ферменти плазми крові, зокрема що беруть участь у процесі згортання крові (див. Система згортання крові).

Встановлено, що в ядрі клітини локалізовані РНК-полімерази (тобто полімерази), тобто ферменти, що беруть участь у синтезі рибонуклеїнових кислот усіх типів. У ядрі містяться ферменти, що каталізують процеси реплікації (див.) та репарації дезоксирибонуклеїнових кислот (див. Репарація генетичних ушкоджень), синтезу НАД та деякі інші. З мітохондріями пов'язані ферменти піруватдегідрогеназного комплексу, циклу трикарбонових кислот, окислення жирних кислот, синтезу сечовини, ферменти дихального ланцюга. ), окисного фосфорилювання (див. Окислення біологічне) та ін. У лізосомах (див.) в основному містяться гідролітичні ферменти з оптимумом ферментативної активності в ділянці pH 5,0. Саме через гідролітичний характер локалізованих у них ферменту ці частки були названі лізосомами. З рибосомами пов'язані ферменти білкового синтезу, що каталізують утворення поліпептидних ланцюгів з окремих амінокислот (див. Білки, біосинтез). В ендоплазматичній мережі локалізовані ферменти синтезу ліпідів (див.), а також ферменти, що беруть участь в реакціях гідроксилювання (ферментна система мікросомного окислення). З плазматичною мембраною насамперед пов'язані АТФ-аза (див. Аденозинтрифосфатази), що забезпечує транспорт іонів Na + і К + , аденілатциклаза (див. Аденозинфосфорні кислоти) та ряд інших ферментів. У гіалоплазмі локалізовані ферменти гліколізу, пентозного циклу, синтезу жирних кислот, мононуклеотидів, активування амінокислот, багато ферментів глюконеогенезу та ін.

Особливу групу ферментів складають поліферментні (мультиферментні), або мультимолекулярні ферментні комплекси (системи), до складу яких входить цілий ряд ферментів, що каталізують послідовні реакції перетворення якого субстрату. Поліферментні системи локалізовані в гіалоплазмі або внутрішньоклітинних структурах таким чином, що кожен фермент розташовується в безпосередній близькості від ферменту, що каталізує наступну реакцію в ланцюгу даної послідовності реакцій. Завдяки такому розташуванню зменшується час, необхідний для дифузії (див.) субстратів і продуктів реакцій, тобто весь ланцюг взаємозалежних реакцій виявляється строго скоординованим у часі та просторі.

Типовим прикладом таких систем є мультиферментні комплекси, що каталізують окисне декарбоксилювання (див.) піровиноградної та акетоглутарової кислот, синтез вищих жирних кислот, а також перенесення електронів від субстратів до кисню через систему дихальних ферментів (див.). Приуроченість ферментних систем до певних внутрішньоклітинних структур або компартменталізація забезпечує протікання в клітині в один і той же час хімічно несумісних реакцій. Так, у клітині одночасно відбувається окислення вищих жирних кислот до ацетил-КоА та протилежно спрямований процес – їх синтез з ацетил-КоА. Ці процеси протікають у різних частинах клітини: окислення жирних кислот – у мітохондріях, а синтез – у гіалоплазмі.

Існують ферменти, які виявляються у різних ділянках клітини. Так, аспартатамінотрансфераза (див.Амінотрансферази) локалізована і в мітохондріях, і в цитоплазмі, проте це два її ізоферменти - мітохондріальний і цитоплазматичний, що різняться по цілій низці фізико-хімічних властивостей. Відомі також мітохондріальна та цитоплазматична форми малатдегідрогенази (див.) та ін.

Розподіл ферментів в органах та тканинах

Практично кожна жива клітина містить свій набір специфічних ферментів, тому їх розподіл у різних органах та тканинах значно варіює. Деякі ферменти зустрічаються лише у певному органі. Прикладами можуть служити орнітин-карбамоїлтрансфераза (КФ 2.1.3.3), яка міститься тільки в печінці, і кисла фосфатаза (див. Фосфатази), найвища активність якої визначається в передміхуровій залозі. Однак багато ферментів виявляються в різних органах і тканинах людини, наприклад лактатдегідрогеназа, аспартат-і аланінамінотрансфе-рази, альдолаза (фруктозобісфосфат-альдолаза; КФ 4.1.2.13) та ін, але присутні в них у різних концентраціях.

Абсолютно чіткі та відтворювані вимірювання активності того чи іншого ферменту у всіх тканинах провести нелегко, оскільки методи отримання тканинного екстракту та переведення ферменту в розчинний стан, придатні для однієї тканини, можуть бути недостатньо ефективними для іншої; аналогічні проблеми існують і при виборі умов виміру активності ферменту.

Внутрішньоклітинна регуляція ферментативної активності

Найпростіший тип регуляції ферментативної активності, тобто регуляції метаболічних процесів, зачіпає основні параметри, що впливають швидкість ферментативної реакції (pH середовища, температура, концентрація субстрату і коферментів, присутність інгібіторів і активаторів).Наприклад, будь-який процес, здатний змінити реакцію середовища всередині клітини, може впливати на швидкість тієї чи іншої ферментативної реакції. Якщо в нормі концентрація субстрату в клітині нижче значення константи Міхаеліса, то швидкість ферментативної реакції різко змінюватиметься залежно від вмісту субстрату.

Інший загальний шлях регуляції метаболічних процесів забезпечується дією про алостеричних ферментів. Важливі уявлення про механізм цього явища були сформульовані французькими дослідниками Ф. Яхакобом, Моно (J. L. Monod) та Шанже (J. P. Changeux) у 1963 році. Вони постулювали положення, згідно з яким зниження або підвищення активності ферментів in vivo зазвичай є наслідком зміни стеричної конфігурації - конформації молекул ферменту в результаті приєднання відповідних інгібіторів або активаторів, в ролі яких виступають різні метаболіти, до інших, некаталітичних ділянках ферментів. Ці ділянки отримали назву алостеричних, або регуляторних, центрів (грецький або інший, інший). В результаті приєднання інгібітора до алостеричного центру ферменту взаємодія його активного центру з субстратом стає неможливим, незважаючи на те, що активні угруповання в каталітичній ділянці ферменту залишаються не блокованими. Навпаки, під впливом алостеричного активатора відбуваються зміни конфігурації активного центру, які призводять до підвищення каталітичної активності ферменту.

p align="justify"> Третім типом регуляції ферментативної активності є зміна концентрації ферменту в результаті стимулювання або інгібування його біосинтезу або зміни швидкості його катаболізму.Існує також регулювання ферментативної активності за допомогою взаємозамінних форм ферментів. Наприклад, фосфорилаза м'язової тканини, що каталізує розщеплення глікогену (див.) до глюкозо-1-фосфату (див. Фосфорилази), може існувати у двох формах – a та b. Молекула фосфорилази складається з чотирьох ідентичних субодиниць, а фосфорилази b - з двох. У фізіологічних умовах практично активною формою є переважно фосфорилаза. Під впливом ряду гормонів та за участю аденілатциклазної системи фосфорилаза b здатна перетворитися на фосфорилазу.

Виділення та очищення ферментів. У клітинах тварин, мікроорганізмів, рослин, у біологічних та культуральних рідинах ферменти знаходяться у складній за хімічним складом суміші. Для виділення та очищення ферментів з метою вивчення їх властивостей, ролі в регуляції обміну речовин та енергії (див.), Застосування в діагностичних або лікувальних цілях користуються різними методами та прийомами. Якоїсь стандартної, універсальної схеми виділення та очищення ферменту немає і не може бути, оскільки структурні та фізико-хімічні відмінності ферментів надзвичайно великі. Разом з тим, можна відзначити певну спільність у методичному підході до розробки конкретних методів виділення та очищення ферментів.

Якщо йдеться про клітинний фермент, то насамперед необхідно зруйнувати клітини та перевести фермент у розчин. Для цього клітинну оболонку можна зруйнувати заморожуванням та розморожуванням клітинної маси, гомогенізацією, розтиранням з подрібненим склом або порошком окису алюмінію, дією ультразвуку та іншими спеціальними методами.Наприклад, у деяких випадках доцільною є обробка клітин ацетоном, при цьому клітинні стінки руйнуються, біомаса зневоднюється, а ферменти залишаються у складі сухого порошку, з якого їх екстрагують буферним розчином.

Незалежно від способу руйнування клітин первинний екстракт, що містить фермент, зазвичай є суспензією зруйнованих клітин у буферному розчині, часто містить добавки різних солей, антиоксидантів та інших речовин.

На наступному етапі очищення ферменту цю суспензію центрифугують для того, щоб відокремити неруйновані клітини, уривки клітинних оболонок, а в ряді випадків ядра, мітохондрії та інші клітинні органели. Надосадова рідина, отримана після центрифугування, містить складну суміш ферменту, структурних білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів та інших сполук. Для видалення баластових речовин, наприклад, нуклеїнових кислот, використовують їх осадження стреітоміцинсульфатом, іротамінсульфатом, поліетиленіміном, для видалення домішкових білків - їх осадження сірчанокислим амонієм, органічними розчинниками (ацетоном, ізопропанолом, етанолом і др.). інші дії. Для видалення низькомолекулярних сполук застосовують діаліз (див.) або фільтрацію через інтактні, хімічно інертні, дисперговані у скляній колонці гелеподібні наповнювачі декстранової природи (див. Гельфільтрація), наприклад, сефадекси G-10, G-15, G-25.

Для більшості ферментів цих прийомів очищення недостатньо, і тоді на наступних стадіях виділення використовують більш тонкі методи фракціонування – електрофорез (див.), изоэлектрофокусировку (див.Ізоелектрична точка), іонообмінну хроматографію (див.), афінну хроматографію та ін.

Ферменти та клінічна медицина

Можна виділити три основних напрями досліджень ферментів, які мають безпосереднє відношення до клінічної медицини. Це – ензімодіагностика, ензімопатологія (див. Ензімопатії) та ензімотерапія (див.).

Ензімодіагностика - використання визначення активності ферментів з метою діагностики. З біохімічних діагностичних методів, які застосовуються в клініці, ферментативні тести є найбільш чутливими та специфічними. Інтерес до дослідження активності ферментів у діагностичних цілях не обмежується визначенням їхньої величини в сироватці крові. Визначення активності ряду ферментів проводять у сечі, цереброспінальній, насіннєвій, синовіальній та інших рідинах; в еритроцитах, лейкоцитах та тромбоцитах активність деяких ферментів визначають насамперед при діагностиці хвороб крові. Нерідко важливе діагностичне значення, особливо у спадкових захворюваннях, має вивчення активності ферментів у матеріалі, отриманому при біопсії.

У клініці при дослідженні активності ферментів у сироватці (плазмі) крові вдається виявити два типи змін - підвищення активності ферментів, або гіперферментемію, яка зазвичай обумовлена ​​порушеннями внутрішньоклітинної організації ферментів та патологічною проникністю клітинних мембран, та зниження активності постійно присутніх у крові ферментів, або гіпоферментемію, яка може бути пов'язана з генетично обумовленими дефектами ферментів або з впливом інгібіторів та інших знижуючих активність ферментів агентів.

Швидкість вивільнення різних ферментів із пошкоджених тканин залежить від кількох факторів. Наз. і десятки тисяч разів. Іншим фактором, що визначає швидкість виходу ферменту з клітини, є розмір молекул, їх відносний мол. вага (маса). Третій фактор - це внутрішньоклітинна локалізація ферментів, їх інтеграція з певними клітинними структурами.

У практиці роботи різних клініко-діагностичних лабораторій знаходять застосування понад 100 ферментних тестів, але найчастіше з них використовують визначення активності асіартатамінтранеферази (Ас АТ), аланінамінотрансферази (АлАТ), креатинфосфокінази (КФК), лакта глута-матдегідрогенази (ГлДГ), сорбітол-дегідрогенази (СДГ), лужної та кислої фосфатаз (ЩФ і КФ), гамма-глутамілтрансферази (Г-ГТФ), лейцинамінопептидази (ЛАП), холінестерази (ХЕ).

Своєчасне визначення активності ряду ферментів у сироватці крові забезпечує ранню діагностику гострого інфаркту міокарда, вірусного гепатиту, панкреатиту, нефриту і нефрозу, системних захворювань крові та ін. гарною, якщо рівень активності ферментів у сироватці крові, який визначається з його допомогою, при патології завжди перевищує норму.Специфічність ферментного тесту вважається високою, якщо активність ферменту в сироватці крові, що визначається з його допомогою, змінюється тільки при якомусь одному захворюванні або невеликій групі хвороб. Однак поки що більшість ферментних тестів, що полягають у визначенні загальної активності будь-якого ферменту в сироватці крові, мало специфічно щодо цього.

Ензимопатологія - вивчення змін активності ферментів при патологічних станах та з'ясування їх ролі у патогенезі захворювань. Насамперед інтереси ензимопатології обмежувалися суворо певним колом спадкових захворювань, що отримали назву ензимопатій. Відомі сотні різних спадкових хвороб, зумовлених вродженим дефектом обміну речовин внаслідок ферментних порушень. До таких хвороб відносяться численні глікозидози, глікозідози, глікогенози, генетично обумовлені порушення обміну амінокислот - фенілкетонурія та ін.

Проте ферментні спектри у тканинах змінюються як при спадкових хворобах, а й за більшості інших захворювань. У зв'язку з цим у 1969 році А. А. Покровський запропонував нове визначення ензимопатій, під якими розумів будь-які стійкі зміни ферментних спектрів органів і тканин, що призводять до розвитку патологічного процесу. Відповідно до класифікації ензимопатій, за А. А. Покровським, існують такі їх види: спадкові ензімопатії, аліментарні ензімопатії, ензімопатії, викликані порушеннями нейрогуморальної регуляції, токсичні ензімопатії, ензімопатії, пов'язані з порушеннями внутрішньоклітинної.

Застосування ферментів та регуляторів їх дії (активаторів та інгібіторів) як лікарських засобів становить вміст ензимотерапії. До 80-х років 20 століття у клініці з лікувальною метою використовували понад 50 різних ферментних препаратів (див.). Так, при розладах травлення широко застосовують кристалічні препарати пепсину як засіб замісної терапії. Дуже важливим і перспективним є використання трипсину та хімотрипсину як протизапальних протинабрякових засобів та засобів, що полегшують видалення в'язких секретів та ексудату при запаленні. У клініці все ширше стали застосовувати препарати гіалуронідази (див.) - Лідазу, ронідазу, є рекомендації щодо використання колагенази (див.). Як фібринолітичні засоби призначають препарат фібринолізин (див.), а також стрептодеказу - препарат стрептокінази (КФ 3.4.99.22) та ін. (Див. Фібрино-літичні засоби).

З лікувальною метою застосовують як самі ферменти, а й їх інгібітори і активатори. Природні інгібітори пептид-гідролаз з успіхом використовують у терапії гострого панкреатиту, артритів, алергічних захворювань. Як лікарські засоби призначають інгібітори карбоангідрази (див.), моноаміноксидази (див.) та інших ферментів. Великі перспективи відкриває клінічне використання інгібіторів ферменту пептидилдипептидази (КФ 3.4.15.1), який здатний координувати дію кінінової та ренін-ангіотензинної систем (див. Кініни) і, отже, брати участь у регуляції судинного тонусу. З лікувальною метою використовують так звані антиферментні речовини - лікарські засоби, вибірково пригнічують активність певних ферментів.

Новий перспективний напрямок пов'язаний з використанням іммобілізованих ферментів. Такі форми ферментних препаратів стрептодеказу має виражену позитивну терапевтичну дію при емболії легеневих артерій та тромбозі коронарних судин.

Гістохімічні методи визначення ферментів у тканинах

Ферменти можна вивчати як за допомогою хімічних, так і гістохімічних методів. та біохімією.

Ферменти каталізують метаболічні реакції, перетворюючи субстрат. Саме на цьому засновано більшість гістохімічних методів виявлення ферментів. ферментів важливо отримати та зробити видимим продукт ферментативної реакції у місці локалізації ферментів.При цьому структура тканин і клітин має бути достатньо добре збережена, що необхідно для встановлення точної локалізації ферментів та оцінки ферментативної активності, особливо при електронно-мікроскопічному дослідженні.

При гістохімічному визначенні ферментів слід якомога точніше дотримуватися таких вимог. Підготовка тканин та зрізів не повинна впливати на розподіл та активність досліджуваного ферменту. Субстрат та допоміжні реагенти інкубаційного середовища повинні проникати у всі клітини та їх компоненти з однаковою швидкістю та не перешкоджати прояву ферментативної активності. Необхідно, щоб субстрат по можливості розщеплювався тільки одним ферментом, а продукт ферментативної реакції допоміжні реагенти вловлювали дуже швидко і незалежно від навколишнього клітини середовища. Потрібно, щоб кінцевий продукт реакції миттєво осаджувався і був практично нерозчинним у водних розчинах та ліпідах, мав аморфну ​​або мікрокристалічну будову і залишався стабільним. Речовини, що беруть участь у реакції, не повинні зв'язуватися або адсорбуватися з будь-якими структурами, крім ферментативно активних. Зазвичай всі ці вимоги задовольнити досить важко, тому кожної гістохімічної реакції підбирають компромісне поєднання необхідних умов.

Гістохімічні методи виявлення ферментів, пов'язані з їх дією на субстрат, ґрунтуються на кількох типах реакцій.

Реакції осадження включають декілька варіантів.Осадження продукту ферментативного розщеплення субстрату іонами металів з подальшим проявом комплексу, що утворюється, у вигляді пофарбованого продукту реакції в місці локалізації ферментів використовується при виявленні фосфатаз, сульфатаз, холінестерази; метод одночасного поєднання, при якому продукт ферментативного розщеплення субстрату вступає в реакцію з поєднуючим агентом з утворенням нерозчинного барвника, застосовується при виявленні фосфатаз, глікозидаз, карбоксилестераз і пептид-гідролаз; ці ж ферменти виявляються за допомогою індигогенних методів, при яких внаслідок реакцій розщеплення та осадження утворюється синє індиго. Тетразолієві методи, засновані на утворенні формазанів в результаті ферментативного окислення субстрату та відновлення солі тетразолію (див. Тетразолію солі), використовуються для виявлення оксидоредуктаз, гексокінази, альдолази та інших ферментів.

Реакції послідовного поєднання проводять у дві стадії: в одному середовищі йде ферментативне розщеплення субстрату з утворенням нерозчинного продукту, в іншій - реакція поєднання цього продукту для візуалізації з відповідним агентом; ці реакції застосовують при виявленні фосфатазу (див.) глікозидаз та інших ферментів.

Реакції синтезу, що використовуються при виявленні деяких трансфераз, протікають у дві стадії і включають синтез з розчинного субстрату нерозчинної речовини, яке робиться видимим за допомогою іншої, спеціальної реакції.

Реакції з використанням субстратної плівки, що містить субстрат або складається з нього, полягають у тому, що на плівку накладають зріз, фермент розщеплює відповідний субстрат, після чого фарбують субстрат, місця локалізації ферменту при цьому залишаються незабарвленими. Цей метод служить виявлення протеаз (див. Пептид-гидролазы), нуклеаз (див.), амилаз (див.).

За допомогою гістохімічних методів отримують інформацію про локалізації та активність ферментів у тканинних зрізах. Однак під час підготовки зрізів ферментативна активність може значно знижуватись. Крім того, в процесі фіксації частково або повністю відмиваються або дифундують з тканини в інкубаційне середовище ті ферменти, які неміцно прикріплені до мембранних структур, отже, за допомогою звичайних гістохімічних методів можна виявляти тільки ферменти, міцно пов'язані з клітинними структурами або вдруге іммобілізовані в результаті фіксації тканини. Для гістохімічного виявлення розчинних ферментів є спеціальні методи, засновані на іммобілізації ферментів у місці їх локалізації.

Головна мета гістохімічних методів виявлення ферментів — насамперед встановлення місця їх точної локалізації, при цьому не так важливо, що іноді не дотримуються оптимальних умов для перебігу ферментативних реакцій, наприклад, при обраній концентрації субстрату не забезпечується кінетика реакцій нульового порядку або реакцію доводиться проводити при неоптимальних значеннях pH та ін.Однак при кількісних гістохімічних дослідженнях необхідно не тільки точно встановити локалізацію різних ферментів, але й визначити відмінності в їхній активності, тому в даному випадку концентрація субстрату, товщина зрізів, час інкубації мають вирішальне значення. Кількісні вимірювання в процесі гістохімічних досліджень ферментів можна проводити за наявності інкубаційних середовищ, що дозволяють виявляти справжні локальні відмінності в ступені активності ферментів без істотних втрат. Ці вимірювання проводять за допомогою цитофотометрії (див.), мікроденситометрії (див. Денситометрія), інтерференційної мікроскопії (див. Мікроскопічні методи дослідження) та інших способів. Мірою ферментативної активності може служити точний час інкубації, необхідне для утворення мікроскопічно реєстрованого продукту реакції в певних порівнюваних ділянках зрізу, а також інші параметри, наприклад, ступінь поглинання проходить світло певної довжини хвилі та ін.

Процедура гістохімічного виявлення ферментів складається з низки етапів: взяття сфоби, подальшої обробки, інкубації. Після взяття проби тканину слід обробляти з максимальною швидкістю, тому що в результаті аутолітичних процесів з часом локалізація та активність ферментів змінюються. Обсяг та кількість матеріалу визначаються завданнями дослідження, характером підготовки, видом органу.

Етапи подальшої обробки залежать від ферменту, що вивчається, завдання дослідження, методу виявлення. Ферменти, чутливі до фіксації (більшість дегідрогеназу, трансферази, цитохромоксидази, ліази), краще вивчати на нефіксованих тканинах.Інші ферменти (тетразолій-редуктази, багато гідролази, деякі пероксидази) виявляють відносну стійкість при фіксації і, отже, можуть бути виявлені у фіксованому матеріалі. Багато ферментів розчиняються, тому мають бути вжиті заходи проти їх переходу в інкубаційний розчин. З цією метою використовують гелеві середовища або напівпроникні мембрани, що діють як дифузійний бар'єр.

Завдання дослідження та обраний метод визначають особливості подальшої обробки. При використанні нефіксованої тканини для отримання зрізів попередньо заморожують. Внаслідок заморожування миттєво припиняються метаболічні процеси, аутоліз, дифузія ферментів та ін. Заморожування необхідно проводити дуже швидко і за низьких температур (не вище — 70°), щоб уникнути утворення кристалів льоду, що руйнують клітини. Для заморожування використовують рідку вуглекислоту (діоксид вуглецю), рідкий азот, пропан, охолоджений рідким азотом, петролейний ефір, гексан або гептан, охолоджені сумішшю ацетону та сухого льоду. Зрізи із замороженої нефіксованої тканини слід робити в кріостаті, а потім поміщати на предметні або покривні скла або напівпроникні мембрани. Методи заморожування - висушування та заміщення в замороженому стані тканинних блоків технічно досить складні, вимагають багато часу і часом дають гірші результати, ніж заморожування - висушування кріостатних зрізів. Останнє забезпечує збереження структур та можливість виявлення практично всіх ферментів, доступних визначенню гістохімічними методами.

Фіксацію застосовують переважно для дослідження внутрішньоклітинної локалізації ферментів.З цією метою зазвичай використовують альдегіди (див.) та їх суміші, фіксацію тканини проводять як у блоках, так і у зрізах. Фіксація в ацетоні з наступним заливанням в парафін плі целоїдин не рекомендується. При фіксації у формальдегіді або глутаральдегіді, які найчастіше використовуються, результати (ферментативна активність, збереження морфологічної структури) залежать від концентрації і чистоти альдегіду, типу розчинника, величини pH, часу фіксації, температури. Розчин формальдегіду слід готувати з параформальдегіду без додавання мурашиної кислоти та метанолу, наявних у комерційному формальдегіді. Розчин глутаральдегіду необхідно періодично очищати від домішок, наприклад шляхом фільтрації через тваринне вугілля. Чутливість різних ферментів до фіксації коливається у межах, і це необхідно враховувати у кожному даному випадку. Для підвищення залишкової активності ферментів тканину після фіксації слід ретельно промити. Ця процедура підвищує залишкову активність ферменту у 2 – 3 рази. Для промивання використовують проточну чи дистильовану воду, різні буферні розчини, фізіологічний розчин, розчин сахарози. Окремі ферменти по-різному витримують промивання: активність деяких з них зростає зі збільшенням часу промивання (такі кисла фосфатаза, арилсульфатаза, НАДН-тетразолій-редуктаза), у цих випадках тканину можна зберігати в рідині для промивання при 4° щонайменше 1 тиждень. Активність інших ферментів зростає лише на початку промивання, а при його продовженні знижується (напр., у лужної фосфатази, АТФ-ази).Методика заморожування фіксованих тканинних блоків для отримання зрізів у кріостаті або (рідше) на мікротомі, що заморожує, в принципі не відрізняється від методики заморожування нефіксованої тканини, за винятком того, що швидкість заморожування фіксованих тканинних блоків не має істотного значення. Температура заморожування коливається від -10 до -30 в залежності від виду рідини, використаної для промивання. Схильність зрізів деяких органів з гетерогенною структурою (шкіра, селезінка та ін.) до розпаду можна запобігти попереднім просочуванням тканинних блоків після промивання гліцерин-желатиною.

У блоках тканини, залитих у парафін, за дотримання низки умов, можна паралельно з отриманням постійно пофарбованих гістологічних препаратів виявити деякі ферменти: лужну фосфатазу, пептидгідролази, глюкамілази в щітковій облямівці; естерази в ендоплазматичному ретикулумі та лізосомах; p-N-ацетилглюкозамінідазу, Р-глюкуронідазу у клітинах з високою фізіологічною активністю.

Відповідальними етапами гістохімічної ідентифікації ферментів є інкубація, що полягає у витримуванні зрізів у середовищі, що містить субстрат та допоміжні реагенти, та приготування препарату, придатного для мікроскопічного дослідження. Інкубацію проводять, як правило, за 37°. Тканини з високою ферментативною активністю слід інкубувати при кімнатній температурі, щоб уникнути надлишкового утворення продукту реакції та його дифузії. Гістохімічне виявлення розчинних ферментів також проводять за кімнатної температури. Іноді потрібна інкубація при 4°, особливо при виявленні кислих гідролазів, пептид-гідролазів, лактази, що знижує неспецифічне фонове забарвлення.При інкубації використовують вільноплаваючі зрізи або зрізи, прикріплені до предметного або покривного скла, при необхідності зрізи можуть бути поміщені на напівпроникні мембрани. Як правило, інкубацію продовжують до отримання задовільної позитивної реакції у досліджуваних клітинах та тканинах. Цей момент легко визначити при застосуванні методик прямого виявлення ферментів (метод одночасного поєднання, індигогенні та тетразолієві методи). При використанні методів непрямого виявлення ферментів (методи із застосуванням солей металів, послідовного поєднання, реакції синтезу, більшість методів із субстратними плівками) розвиток реакції не піддається візуальному контролю. у цих випадках потрібно інкубувати одночасно кілька зрізів та виявляти їх через різні інтервали часу.

Загальні принципи гістохімічного виявлення ферментів за допомогою світлового мікроскопа, викладені вище, лежать в основі численних методів та електронно-мікроскопічного виявлення ферментів (див. Електронна мікроскопія). Особливість електронно-мікроскопічного виявлення ферментів полягає в необхідності отримання продукту гістохімічної реакції, що непроникний або мало проникний для електронів, що дає електронно-щільний осад. Якщо відразу утворюється нерозчинний продукт реакції, то у разі його достатньої електронної щільності він може безпосередньо служити ультраструктурним маркером місця знаходження ферментів, інакше доводиться шляхом спеціальної обробки з використанням осміофільних реагентів переводити продукт реакції в електронно-щільне з'єднання.Однак частіше інкубаційне середовище містить прециитирующий металевий реагент, за допомогою якого продукт ферментативного розщеплення відразу ж перетворюється на випадає в осад сіль металу, добре видиму при ультраструктурному дослідженні завдяки високій електронній щільності.

Детально методи гістохімічного виявлення ферментів - див.

Ферменти у судово-медичному відношенні

Якісні та кількісні дослідження ферментів знайшли широке застосування в судовій медицині при проведенні наукових досліджень, а також в експертній практиці. та Р-420) для судово-медичного встановлення строку давності настання смерті. застосовують як визначення активності одного ферменту в органах, для яких характерні різні терміни переживання припинення серцевої діяльності, так і комплексне дослідження одного органу, тканини або рідкого середовища людського організму з визначенням в них активності різних ферментів. сукцинатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфат дегідрогенази, кислої та лужної фосфатаз, катепсинів (див.), холінестеразної та цитохромоксидазної активності у поєднанні з іншими методами дослідження дозволяють досить точно відповісти на питання про час настання смерті, якщо термін давності настання смерті не перевищує 48 год.Визначення активності та кількісна оцінка вмісту ферментів знайшли застосування також і при діагностиці факту прижиттєвого походження та давності заподіяння механічних ушкоджень м'яких тканин та внутрішніх органів.

Широке використання в експертній практиці знайшов метод експрес-діагностики отруєння фосфорорганічними сполуками, заснований на визначенні активності холінестерази в сироватці крові, так як активність цього ферменту різко знижується аж до повного зникнення при отруєнні цими сполуками.

Дослідження ферментів застосовують і під час вирішення деяких питань ідентифікації особистості (див.). Зокрема, визначення ізоферментного спектру кислої фосфатази еритроцитів, фосфатдегідрогенази, лейцинамінопеїтидази, встановлення фенотипу холінестерази, фосфо-глюкомутази, аденілаткінази застосовують при дослідженні плям крові для виключення можливого її походження від конкретного підозрюваного.

Дослідження ізоферментного складу ЛДГ (виявлення ізоферментів ЛДГ, специфічних для насіннєвої рідини, навіть у випадках, коли сперматозоїди відсутні), визначення активності кислої фосфатази, дуже високої в спермі, застосовують для доказу спермального походження плям.

Визначення фенотипу лейцин-амінопептидази, зокрема виявлення починаючи з 8-10-го тижня вагітності і зберігається до 3 тижнів після пологів додаткової фракції цього ферменту, застосовують для діагностики вагітності і колишніх пологів при дослідженні рідкої крові та її плям.

Бібліогр.: Березов Т. Т. і Коровкін Б. Ф. Біологічна хімія, 1.1., 1983; Введення в прикладну ензимологію, під ред. І. Ст Березіна і К. Мартінека, М., 1982; Вілкінсон Д.Принципи та методи діагностичної ензимології, пров. з англ., М., 1981; Діксон М. та Вебб Е. Ферменти, пров. з англ. 1 - 3, М., 1982; Іванов І. І., Коровкін Б. Ф. та Маркелов І. М. Введення в клінічну ензимологію, Л., 1974; Кочетов Г. А. Практичний посібник з ензимології, М., 1980; Курганов Би. І. Алостеричні ферменти, М., 1978; Ленінджер А. Біохімія, пров. з англ., М., 1976; Лойда 3., Держсpау Р. та Шиблер Т. Гістохімія ферментів, пров. з англ., М., 1982; Мельников Ю. Л. та Жаров В. Ст. Судово-медичне визначення часу настання смерті, М., 1978; Мосс Д. та Баттерворт П. Ензимологія та медицина, пров. з англ., М., 1978; Науменко В. р. та Мітяєва Н. А. Гістологічний та цитологічний методи дослідження в судовій медицині, М., 1980; Номенклатура ферментів, пров. з англ., під ред. е. Браунштейна, М., 1979; Пірс А. Гістохімія, пров. з англ., М., 1962; Туманов О. До. Основи судово-медичної експертизи речових доказів, М., 1975; Monod J., Сhangeux J. - P. a. Jacob F. Alios erie proteins and cellular control systems, J. molec. Biol., v. 6, p. 306, 1963.

З. З. Дебов, Би. Ф. Коровкін, І. І. Вотрін (біохім.); І. Ст. Буромський (суд), H. Т. Райхлін, А. р. Уфімцева (гіст.).

Гормон сну

Порушення сну створює безліч проблем у житті. Безсоння, недосипання, сонливість у денний час – все це не лише неприємно, а й небезпечно для здоров'я. Такі порушення зазвичай пов'язані з нестачею мелатоніну – гормону сну. Це основний гормон епіфіза, синтез якого схильний до добових коливань – переважно він виробляється в темний час доби. Підвищити його вміст можна природним шляхом за допомогою режиму та продуктів харчування.Якщо це неефективно, починають прийом медикаментозних препаратів.

Де виробляється

Найбільше мелатоніну синтезується в эпифизе – шишковидной залозі. В епіфізі також виробляється серотонін та інші важливі для організму речовини.

В епіфізі гормон починає виділятися у відповідь на реакцію зорових рецепторів, які дають сигнал про настання темряви.

Але епіфіз не єдиний орган, у якому виробляється гормон сну. Поза головним мозку він синтезується у таких структурах організму:

• шлунково-кишковий тракт;
• нирки та надниркові залози;
• печінка, жовчний міхур;
• підшлункова залоза;
• дихальні шляхи;
• яєчники, ендометрій.

Клітини, які виробляють мелатонін поза епіфізом, відносяться до дифузної нейроендокринної системи. Їхня робота не залежить від рівня освітленості.

Що потрібно для вироблення

Продукція мелатоніну в організмі людини залежить від кількох факторів – освітленості, амінокислоти триптофану, функціонування ферментативної системи.

Триптофан

Мелатонін в організмі виробляється з триптофану - амінокислоти, яка є попередником серотоніну. А серотонін, своєю чергою, під впливом спеціальних ферментів перетворюється на мелатонін. Якщо в організмі триптофану недостатньо, це може спричинити проблеми із засипанням.

Освітленість

Продукція гормону багато в чому залежить від рівня освітленості. Яскраве світло знижує його вироблення. Секреція гормону в епіфізі запускається у відповідь на сигнал від зорової системи про настання темряви. Тому зниження освітленості підвищує рівень мелатоніну.

Коли виробляється

Мелатонін – це гормон, який виробляється уночі. Зміни його концентрації мають помітний добовий ритм – рівень гормону підвищується у вечірній час, досягає максимуму вночі, а вранці та протягом дня його кількість у крові незначна. Максимальна концентрація у крові припадає в середньому на 2 години ночі за місцевим часом. На нічний час припадає приблизно 70% добової продукції.

За що відповідає

Основну дію мелатонін робить на регуляцію циклу сну та неспання. Але на цьому його вплив не закінчується, дія гормону поширюється на інші процеси в організмі.

Роль у регуляції сну

Мелатонін це основний гормон, який відповідає за сон.

Він бере участь у створенні циркадного ритму – впливає на клітини ендокринних органів, впливає на продукцію інших гормонів. Крім того, він регулює кров'яний тиск, періодичність сну, зменшує емоційну та фізичну активність.

Через такі добові коливання з настанням темряви хочеться спати. Однак нормальне вироблення гормону – це ще не запорука швидкого засинання. Він регулює сон, але не викликає його. Вважається, що під впливом гормону відкриваються так звані ворота сну, але при цьому не активуються структури мозку, які відповідають за засипання.

Інші функції

Роль мелатоніну не обмежується лише впливом на цикл сну та неспання. Він має й інші властивості.

Вплив на ендокринну систему

Полягає у пригніченні синтезу гонадотропінів, соматотропіну, кортикотропіну та тиреотропіну.

Мелатонін є гормоном молодості та довгого життя. Він може поглинати вільні радикали, що захищає організм людини від вільнорадикального ушкодження.Це запобігає старінню та в'яненню шкіри.

Боротьба зі стресом

Має антистресовий ефект. Під його впливом знижується тривога та негативні емоційні реакції, нормалізується діяльність ендокринних органів, яка була порушена в період стресу.

Бере участь у стимуляції імунної системи. Він підвищує активність імунних клітин – фагоцитів, лімфоцитів. Це запобігає розвитку низки захворювань (інфекційних, онкологічних).

Як покращити вироблення

Підвищити природний рівень мелатоніну можна за допомогою режиму. Рекомендується лягати в один і той же час, а спати потрібно в темній кімнаті, оскільки це підвищує вироблення гормону сну. Штучно покращити сон можна за допомогою продуктів харчування та медикаментозних препаратів.

Медикаментозні препарати

Лікування безсоння може включати використання препаратів, що містять мелатонін. Вони випускаються у формі пігулок для перорального застосування. Наприклад:

Також мелатонін випускається у вигляді харчової добавки та доступний у магазинах спортивного харчування. Препарат, в якому він міститься, сприяє усуненню безсоння, знімає втому та дратівливість. Сон стає глибоким та спокійним, нормалізується робота ендокринних органів, розслаблюються м'язи, відпочиває центральна нервова система.

Приймати таблетки потрібно після консультації з лікарем. Зазвичай препарат добре переноситься, але можуть виникати такі побічні ефекти:

1. З боку центральної нервової системи: сонливість, біль голови, незвичайні сновидіння, запаморочення, порушення пам'яті та уваги, депресія, дратівливість.
2. З боку шлунково-кишкового тракту: нудота, блювання, метеоризм.
3. Алергічні реакції: шкірні висипання, свербіж.

Протипоказано застосовувати препарат під час вагітності та годування груддю, а також дітям віком до 14 років. При прийомі таблеток слід звернути увагу на їхню сумісність з іншими медикаментами. Наприклад, седативні препарати, антидепресанти, транквілізатори, ацетилсаліцилова кислота, бета-адреноблокатори зменшують очікуваний ефект. Така сама дія надає прийом алкоголю.

Важливо дотримуватись рекомендацій щодо застосування препарату – за 30 хвилин до відходу до сну. Якщо прийняти його в неправильний час, препарат може спричинити багато проблем. Наприклад, перевести внутрішній годинник не в той бік, що тільки посилить проблеми із засипанням.

Тривалість прийому визначається індивідуально. У деяких випадках для нормалізації сну достатньо кількох днів. Якщо ж потрібний тривалий прийом, обов'язково потрібно робити перерву на тиждень через кожний місяць застосування.

Препарат показаний не тільки для лікування безсоння, але також для полегшення адаптації при зміні часових поясів. У цьому випадку таблетки приймаються за добу до майбутнього вильоту, а потім ще через 1–2 дні після прильоту. Це дозволить мінімізувати наслідки порушення добового ритму.

Продукти харчування

Щоб краще спати, можна вживати продукти, які містять мелатонін або триптофан – його попередник. Позбутися безсоння можна, додавши до раціону:

Продукти з високим вмістом триптофану

Молочні продукти: молоко, тверді сорти сиру, сир.

М'ясо птиці: курка, індичка.

Вівсяна каша, цільнозерновий хліб.

Горіхи: кедрові, мигдаль, фундук.

Продукти з високим вмістом мелатоніну

Ягоди: вишня, черешня.

Томати, морква, редька.

Рекомендується регулярно включати у вечірній прийом їжі будь-який продукт із цього списку.

Регуляція сну у людей похилого віку

Нестача мелатоніну часто відіграє ключову роль у віковому безсонні – з роками активність епіфіза знижується. Тому у людей похилого віку сон часто стає поверхневим і неспокійним, у них спостерігаються труднощі із засинанням, рідше – ранні пробудження. Після пробудження людина не почувається бадьорою і відпочившою, має місце сонливість. Тому для них особливо важливо дотримуватися рекомендацій щодо покращення синтезу мелатоніну.

Відео

Пропонуємо до перегляду відео на тему статті.

Про автора

Знайшли помилку у тексті? Виділіть її та натисніть Ctrl+Enter.

Коли закохані цілуються, кожен з них втрачає 6,4 ккалорій на хвилину, але вони обмінюються майже 300 видами різних бактерій.

Найвищу температуру тіла було зафіксовано у Віллі Джонса (США), який надійшов до лікарні з температурою 46,5°C.

Загальновідомий препарат "Віагра" спочатку розроблявся для лікування артеріальної гіпертонії.

У прагненні витягнути хворого, лікарі часто перегинають ціпок. Приміром, якийсь Чарльз Йенсен у період із 1954 по 1994 гг. пережив понад 900 операцій із видалення новоутворень.

Навіть якщо серце людини не б'ється, то вона все одно може жити протягом довгого проміжку часу, що продемонстрував нам норвезький рибалка Ян Ревсдал. Його "мотор" зупинився на 4 години після того, як рибалка заблукав і заснув у снігу.

Згідно з дослідженнями, жінки, які випивають кілька склянок пива або вина на тиждень, мають підвищений ризик захворіти на рак грудей.

Люди, які звикли регулярно снідати, набагато рідше страждають на ожиріння.

Американські вчені провели досліди на мишах і дійшли висновку, що кавуновий сік запобігає розвитку атеросклерозу судин. Одна група мишей пила звичайну воду, а друга – кавуновий сік. В результаті судини другої групи були вільні від бляшок холестерину.

Робота, яка людині не до душі, набагато шкідливіша для її психіки, ніж відсутність роботи взагалі.

Багато наркотиків спочатку просувалися на ринку, як ліки. Героїн, наприклад, спочатку було виведено ринку як ліки від дитячого кашлю. А кокаїн рекомендувався лікарями як анестезія і як засіб, що підвищує витривалість.

Вчені з Оксфордського університету провели низку досліджень, у ході яких дійшли висновку, що вегетаріанство може бути шкідливим для людського мозку, оскільки призводить до зниження його маси. Тому вчені рекомендують не виключати повністю зі свого раціону рибу та м'ясо.

На ліки від алергії тільки в США витрачається понад 500 млн. доларів на рік. Ви все ще вірите, що спосіб остаточно перемогти алергію буде знайдено?

Кров людини «бігає» судинами під величезним тиском і за порушення їх цілісності здатна вистрілити з відривом до 10 метрів.

Вага людського мозку становить близько 2% від усієї маси тіла, проте споживає він близько 20% кисню, що надходить у кров. Цей факт робить людський мозок надзвичайно сприйнятливим до ушкоджень, спричинених нестачею кисню.

У Великій Британії є закон, згідно з яким хірург може відмовитися робити пацієнтові операцію, якщо він курить або має надмірну вагу. Людина повинна відмовитися від шкідливих звичок, і тоді, можливо, їй не потрібне оперативне втручання.