Активний транспорт

Активний (тобто енергозалежний) транспорт молекул через мембрану проти градієнта концентрації здійснюється за участю мембранних білків, що використовують для транслокації енергію гідролізу АТФ. На відміну від пасивного транспорту, що йде мимовільно, білки-переносники повинні не тільки транспортувати молекулу через мембрану, але й мати АТФ-азну дію, т.е. е. каталізувати гідроліз АТФ, що є основним джерелом енергії для активного транспорту. Залежно від способу використання енергії для транспорту молекул виділяють первинно-і вторинно-активний транспорт. При первинно-активному Донором транспортної енергії є безпосередньо молекула АТФ і процес перенесення речовини через мембрану супроводжується її гідролізом.

• • натрій-калісвий насос - № + /К + -аденозинтрифосфатаза (Ыа + /К + -АТФ-аза), що переносить іони натрію з клітини, а калію - в клітину;
• • кальцієвий насос - Са 2+ -АТФ-аза, який транспортує Са 2+ з клітини або цитозолю в саркоплазматичний ретикулум;
• • Н + -АТФ-аза — протонний насос, що функціонує в сполучних мембранах, у тому числі в мітохондріальній мембрані, де Н + -АТФ-аза працює у зворотному напрямку, використовуючи ДР + , що утворюється вдихального ланцюга для синтезу АТФ (гл. 15) .

Для активного транспорту, як і для полегшеної дифузії, характерні висока специфічність, ефект насичення транспортних білків молекулами, що транспортуються, коли кінетична крива виходить на плато, а також дія інгібіторів.

Як приклад первинно-активного транспорту можна навести транспорт, здійснюваний № + /К + -АТФ-азою, як однієї з найбільш важливих і поширених активних транспортних систем в плазматичної мембрані тварин клітин. Ця система, що отримала назву Na + -K * - Hacoca, відповідає за підтримку в клітині високої концентрації К + і низькою Na + шляхом перенесення К + всередину клітини, a Na + з клітини назовні проти градієнта їх концентрації і тому потребує витрати АТФ. Виявляється, у тваринній клітині внутрішньоклітинна концентрація іонів калію приблизно в 30 разів вища, а іонів натрію в 10 разів нижча, ніж у навколишньому середовищі. Така асиметрія іонного складу визначає вміст води та іонний склад у клітині, електричну збудливість нервових та м'язових волокон, що служить рушійною силою для транспорту в клітину цукрів та амінокислот, є важливим фактором у процесі біосинтезу білка.

Мал. 22.8. Структура Na+, К*-залежної АТФ-ази

№ + /К + -АТФ-аза було відкрито 1957 р. Й. Скоу у фракції плазматичних мембран нервів краба, згодом вона була виявлена ​​у всіх досліджених клітинах тварин, особливо великий вміст в органах, що здійснюють інтенсивний сольовий обмін (нирки) або виконують електричну роботу (мозок, нерви).

№ + /К + -АТФ-аза є олігомерний білок, що складається з субодиниць двох типів (а і Р), що входять до складу ферменту в еквімолярних кількостях. Велика а-субодиниця (-112 kDa) формує каталітично активний центр, що здійснює гідроліз АТФ; менша р-субодиниця (-45 kDa) глікозильована, при цьому вуглеводні ланцюги експоновані на зовнішній стороні мембрани (рис. 22.7).

Активний фермент містить як мінімум 2а- та 2р-субсдиниці, які щільно інтегровані в мембрану та активуються іонами Mg 2+ . В даний час експериментально доведено, що Ыа + /К + -АТФ-аза є як енергоперетворюючою частиною Na + / K + -насоса, так і сама здійснює активний транспорт Na + і К + , пов'язаний з гідролізом АТФ, т. е. переносить катіони проти концентрації градієнта. Описано два конформаційні стани АТФ-азного комплексу з різним енергетичним рівнем, які прийнято позначати ?, і ?^. Конформація ?, має канал, відкритий всередину клітини, та ділянки, що специфічно зв'язують іони

Na+ (дсфосфорильована форма АТФ-ази). При переході у конформацію Е₂ відбувається переорієнтація комплексу в мембрані, канал відкритий на зовнішню сторону мембрани та фермент специфічно пов'язує іони К+ (фосфорильована форма АТФ-ази).

За загальноприйнятим поданням, механізм дії АТФ-ази включає кілька стадій (рис. 22.9).

Мал. 22.9. Механізм функціонування NaVK-АТФ-ази

• 1. Молекула АТФ з цитоплазми зв'язується з активним центром однієї з а-суб'здиниць АТФ-ази (конформація?,). Приєднання АТФ супроводжується зв'язуванням трьох іонів натрію, що активує каталітичну активність ферменту, відбувається гідроліз АТФ, при цьому фосфорилюється карбоксильна група бічного ланцюга залишку аспарагінової кислоти іншої субодиниці.
• 2. Фосфорилювання ферменту призводить до переходу його в конформацію Е₂ і переорієнтації в мембрані таким чином, що пов'язані 3Na+ виводяться через канал, відкритий на зовнішню сторону, оскільки АТФ-аза втрачає спорідненість до цих іонів.
• 3. Конформація Е₂ ферментного білка має сайти, специфічні до іонів К + і два іони К + приєднуються до іонзв'язуючих центрів фосфорильованого білка.
• 4. Відбувається (можливо, мимовільний) гідроліз фосфоефірного зв'язку та дефосфорилювання ферменту, що викликає його перехід у вихідну конформацію. при якій іонний канал відкритий всередину клітини, через нього два іони К+ виходять у цитоплазму.

На кожну витрачену молекулу АТФ фермент переносить три іони Na ​​+ з клітини та два іони К + в клітину, т.е. е. перенесення катіонів нееквівалентне. Таким чином, на мембрані виникає різниця концентрацій та електричних потенціалів, і третій іон К+ надходить у клітину вже за механізмом вторинноактивного транспорту.

Транспорт речовин через клітинні мембрани

Концепція мембранного транспорту. Мембранний транспорт речовин — це перехід речовини із позаклітинного середовища у внутрішньоклітинне, або, навпаки, із внутрішньоклітинного у позаклітинне середовище. Крім того, розрізняють транспорт речовин з цитоплазми у внутрішньоклітинні відсіки (департаменти) або, навпаки, з відсіків у цитоплазму (наприклад, вихід іонів Са 2+ з термінальних цистерн саркоплазматичного ретикулюму в саркоплазму, що відбувається в м'язовому волокні). Будь-який вид транспорту визначається властивостями речовини, що переноситься - її здатністю розчинятися у воді, його розмірами, хімічними властивостями, а також градієнтом (різницею) концентрації між зовнішньою і внутрішньою поверхнею плазматичної мембрани.

• 1. Гідрофобні речовини добре проходять через плазматичні мембрани.Тому їх транспорт визначається переважно наявністю і спрямованістю градієнта концентрації: речовина рухається відповідно до законів термодинаміки з його високої концентрації в область, де концентрація цієї речовини нижче.
• 2. Гідрофільні речовини не можуть вільно проходити через плазматичні мембрани, навіть якщо вони мають невеликі розміри. Для їхнього транспорту необхідні або спеціальні частинки - транспортери, або спеціальні механізми, в основі яких лежить зміна форми клітини.

• 3. Якщо перенесення речовини відбувається за участю транспортної частки (переносника), то в цьому випадку можливі два варіанти. Перший варіант – перенесення по градієнту концентрації. Такий вид транспорту не вимагає для своєї реалізації в даний час витрати енергії (вона витрачається раніше, при створенні такого градієнта); тому його умовно називають пасивним транспортом. Другий варіант – перенесення речовини проти градієнта його концентрації. В цьому випадку необхідна витрата вільної енергії (використовується енергія, що звільняється при гідролізі АТФ, тобто внаслідок дисоціації цієї молекули на АДФ та неорганічний фосфат). Такий вид транспорту отримав назву активний транспорт. Таким чином, можна говорити про наявність усередині плазматичної мембрани двох типів переносників – пасивних та активних.
• 4. Процес транспортування речовин через плазматичну мембрану може регулюватися, тому проникність конкретної речовини — величина, змінювана у часі. Особливо цей принцип важливий щодо іонів натрію, калію, кальцію та хлору.У збуджених клітинах є спеціальні механізми регулювання проникності мембрани для зазначених іонів, що дозволяють змінювати її в широких діапазонах, у тому числі до повного припинення транспортування іона. При цьому існують два основні механізми такого регулювання: за рахунок зміни рівня мембранного потенціалу (потенціал-залежний механізм) або за рахунок активації специфічних клітинних рецепторів (рецептор-керований механізм).

Класифікація механізмів транспортування речовин через біологічні мембрани. З урахуванням наведених вище принципів можна розглянути сучасний варіант класифікації всіх видів мембранного транспорту.

Розрізняють прямий та опосередкований транспорт. Прямий транспорт здійснюється без участі переносників та без витрати енергії. Він здійснюється шляхом дифузії чи фільтрації, т. е. на кшталт пасивного транспорту. Прикладом такого виду транспорту є перенесення кисню як жиророзчинної речовини. Опосередкований транспорт у всіх випадках відбувається за участю переносника. При цьому в одних випадках цей вид транспорту йде без витрати енергії (полегшена дифузія), а в інших – із витратою енергії (активний транспорт).

Активний транспорт може протікати механізмом первинноактивного і вторинно-активного транспортів. При первинно-активному транспорті енергія витрачається на перенесення даної речовини (наприклад, транспорт іонів натрію за допомогою натрієвого насоса), а при вторинно-активному транспорті енергія витрачається на перенесення іншої речовини, внаслідок чого виникає можливість переносити й іншу речовину (наприклад, перенесення глюкози проти градієнта концентрації за рахунок енергії, витраченої на перенесення іонів натрію проти градієнта його концентрації.

Окремо виділяють транспорт, пов'язаний з перенесенням двох речовин (котранспорт), який може протікати за типом симпорту (дві речовини йдуть в одному напрямку, наприклад, іони Na ​​+ з молекулою глюкози) або за типом антипорту (одна речовина йде в клітину, друга - з клітки; наприклад, так працює Na-K-насос) (рис. 1.2).

Мал. 1.2. Транспорт речовин через клітинну мембрану:

А - види транспорту, Б - Котранспорт

Крім того, як варіант активного транспорту, тобто транспорту з витратою енергії, розрізняють транспорт із зміною архітектури мембрани – екзоцитоз, ендоцитоз та трансцитоз. У цьому випадку велика молекула, наприклад білкова молекула, або група молекул (квант медіатора) викидається за межі клітини (екзоцитоз; як приклад – викид медіатора з пресинапсу), або його вхід у клітину (ендоцитоз; як приклад – зворотне захоплення медіатора із синаптичної щілини пресинапс), а при трансцитозі велика молекула входить за механізмом ендоцитозу в клітину з одного боку і виходить із клітини за механізмом екзоцитозу з іншого боку (як приклад – процес перенесення речовин в ендотеліоцитах судин).

Розглянемо окремі види транспорту, що має першорядне значення у діяльності збудливих клітин.

Пасивний транспорт Розрізняють два його види - просту дифузію та полегшену дифузію. Механізм простої дифузії здійснюється перенесення дрібних жиророзчинних молекул (0₂, С0₂ та ін). Дифузія йде зі швидкістю, пропорційною градієнту концентрації або градієнту напруги речовин, що транспортуються (відповідно до закону Фіка).

Наділена дифузія здійснюється через специфічні канали (зокрема специфічні іонні канали) чи з участю специфічних білків-переносників.У тому й іншому випадку ці структури є інтегральними мембранними білками, а саме перенесення речовини йде без витрати енергії - за рахунок хімічного або електрохімічного градієнта. За допомогою білків-переносників збудливі клітини (як і інші клітини) одержують із позаклітинного середовища амінокислоти, моноцукору (наприклад, глюкозу), які транспортуються в клітину за градієнтом концентрації.

Важливо відзначити, що цей вид транспорту регулюється за участю гормонів, наприклад, інсуліну — гормону, що продукується бета-клітинами острівців Лангерганса підшлункової залози. Цей гормон підвищує спорідненість переносника до глюкози та амінокислот і тим самим збільшує швидкість полегшеної дифузії. За відсутності продукції інсуліну або за відсутності на поверхні клітин специфічних інсулінових рецепторів швидкість транспорту глюкози та амінокислот знижується, що порушує метаболічні процеси в клітині та призводить до необхідності використовувати інші нутрієнти (поживні речовини) для енергетичних та пластичних потреб клітини.

Іонні канали - це інтегральні білки мембрани, які виконують функцію частки, що транспортує, для відповідного іона. По суті, це теж переносники, але їх здатність транспортувати іони, тобто іонна проникність, регулюється за допомогою спеціальних механізмів, залежних від рівня мембранного потенціалу або стану специфічних клітинних рецепторів, керованих цими каналами. Крім того, зміна іонної проникності, особливо у потенціал-залежних іонних каналів, може відбуватися з величезною швидкістю - канал може відкриватися лише на 1-3 мс.

Селективність іонного каналу забезпечується за рахунок геометрії каналу (діаметр усть, діаметр селективного фільтра), за рахунок внутрішньоканально розташованих заряджених частинок (наприклад, для катіон-пропускних каналів - аніонні частинки).

Кожен іонний канал складається з власне транспортної системи та комірного механізму, який відкриває канал на деякий час у відповідь на зміну мембранного потенціалу, або у відповідь на зв'язування сигнальної молекули (ліганда) з рецептором, або на механічну дію. гирло, селективний фільтр, ворота та механізм управління воротами. Частина каналів управляється за рахунок різниці потенціалів на мембрані. (потенціал-залежні іонні канали) - для цього в каналі є електричний сенсор, який залежно від величини мембранного потенціалу або відкриває ворота каналів, або тримає закритими.

Другий варіант іонних каналів - рецептор-керовані канали. У цьому випадку ворота каналу управляються за рахунок рецептора, розташованого на поверхні мембрани: при взаємодії медіатора з цим рецептором може відбуватися відкриття іонних каналів.

Третій варіант іонних каналів - механокеровані канали, проникність яких змінюється під впливом механічної сили, що додається до мікроворсинки (наприклад, як це відбувається у волоскових клітинах внутрішнього вуха).

Селективність іонних каналів багато в чому визначається геометрією каналу. Наприклад, кристалічний діаметр іону натрію - 0,19 нм, разом з гідратною оболонкою його діаметр досягає приблизно 0,3 нм.Для того щоб пройти через такий канал (головне - через його селективний фільтр), іон натрію або інший іон повинен звільнитися від гідратної оболонки і тільки в голому вигляді іон може пройти через канал. Надто «великий» іон не може увійти в канал, а надто «маленький» — не здатний віддати гідратну оболонку в селективному фільтрі, тому не може вискочити з каналу.

Спрямованість потоку іонів визначається хімічним та електрохімічним градієнтом. Зокрема, відомо, що в цитоплазмі збудливих клітин концентрація іонів Na + становить 14 мМ, а в позаклітинному середовищі — 140 мМ. Тому пасивний потік іонів Na + по натрієвих каналах спрямований з позаклітинної сре-

ди в цитоплазму. Аналогічна ситуація для потоку іонів Са 2+ , оскільки у позаклітинному середовищі їх концентрація набагато більша (2,5 х 10 3 М), ніж у цитоплазмі (10 7 М). Потік іонів К+ по калієвих каналах спрямований, навпаки, із клітини у середу, оскільки концентрація цих іонів у цитоплазмі набагато більша, ніж у позаклітинному середовищі (150 мМ проти 4-5 мМ).

Активний транспорт Як уже зазначалося вище, розрізняють первинно-активний транспорт, при якому енергія гідролізу АТФ витрачається на перенесення даної речовини проти градієнта його концентрації, а також вторинно-активний транспорт, при якому енергія на перенесення цієї речовини (наприклад, молекули глюкози) використовується за рахунок механізму перенесення іншої речовини (наприклад, натрію).

Первинно-активний транспорт широко представлений організмі. Це Na-K-насос багатьох плазматичних мембран, Са-насоси плазматичних мембран та мембран саркоплазматичного ретикулюму, натрій-водневий обмінний механізм, натрій-кальцієвий обмінний механізм та інші іонні насоси.В даний час встановлено, що всі ці іонні насоси збудливих клітин, що транспортують іони проти градієнта концентрації, сконструйовані і функціонують однотипно - вони являють собою сімейство білків-ферментів, або ензимів, які отримали загальну назву іонтранспортуючих АТФ-аз P-типу, або Е_ГЕ₂- Типу. Ці насоси працюють за рахунок енергії гідролізу АТФ, яка витрачається на зміну конформаційної структури молекули-переносника, в результаті якого змінюється спорідненість до іона і положення місця зв'язування даного іона.

Якщо, наприклад, іони Са 2+ повинні переноситися з цитоплазми у зовнішнє середовище, Са-насос має місця зв'язування цих іонів на стороні, зверненій до цитоплазми. Ці місця мають високу спорідненість до іонів Са 2+ , завдяки чому навіть за умов високої концентрації серед іонів Са 2+ ці іони зв'язуються Са-насосом. В результаті зв'язування підвищується АТФ-азна активність насоса, що викликає гідроліз АТФ та вивільнення енергії (фосфорилювання білка). Фосфорилювання змінює конформацію білка-насоса, у результаті місця зв'язування іонів Са 2+ переміщуються на зовнішню поверхню клітини і одночасно ці місця втрачають спорідненість до іонів Са 2+ . Тому ці іони залишають насос у зовнішньому середовищі. Зв'язування насосом АТФ повертає його у вихідний стан і цикл повторюється знову.

У цьому прикладі, детальніший виклад якого дано у розділі «Фізіологія скелетних м'язів», переноситься одне вид іонів — іони Са 2+ , т. е. має місце варіант активного уніпорта.Інший вид іонного насоса - Na-K-насос, або Na-K-АТФ-аза, здійснює активне перенесення відразу двох іонів - іонів Na + , які переносяться проти градієнта їх концентрації з цитоплазми в навколишнє середовище, і іонів К +, які , Навпаки, переносяться із зовнішнього середовища в клітину. Таким чином, можна говорити про те, що цей насос "відкачує" іони Na ​​+ з клітини і вкачує в неї іони К +. Щоб здійснити перенесення натрію з клітини в середу, Na-K-АТФ-аза всередині клітини, внаслідок високої спорідненості до іонів Na + приєднує їх до себе. В результаті цього підвищується АТФ - азна активність білка-переносника, відбувається гідроліз АТФ, це викликає вивільнення енергії, в результаті змінюється конформаційний стан молекули-насоса. Це призводить до транслокації місць зв'язування іонів Na + на зовнішню поверхню клітини, зниження їх спорідненості до іонів Na + , відхід їх у навколишнє середовище. Одночасно у молекули-насоса з'являється висока спорідненість до іонів К+ і АТФ. Приєднання цих двох речовин до насоса знову викликає конформаційну перебудову, в результаті якої відбувається повторна транслокація місць зв'язування іонів К+ та зниження спорідненості до нього. Іони К+ залишають насос усередині клітини, а місця зв'язування набувають високої спорідненості до іонів Na+. Цикл повторюється. Слід зазначити, що зазвичай Na-K-насос працює в електрогенному режимі: на три іона Na+, що виводяться з клітини, всередину клітини вводиться два іони К+.

Нині встановлено, що це АТФ-азы є мембранними мономерними білками, т.к. е. складаються з поліпептидного ланцюга, який неодноразово пронизує мембрану.На петлях, що з'єднують внутрішньомембранні домени, розташовуються різні місця (сайти) для зв'язування іона, АТФ, фосфатної групи, що переноситься (це місце фосфорилювання білка-насоса, тобто місце «прийому» енергії, в результаті якого здійснюється конформаційна перебудова насоса) , а також місця зв'язування регуляторів активності насоса. Так, Na-K-АТФ-аза має спеціальне місце для зв'язування уабаїну, або строфантину G, який є інгібітором активності цього насоса (перебуваючи на молекулі насоса, уабаїн перешкоджає фосфорилювання насоса).

У кальцієвих насосах виявлені інші природою регулятори активності. Наприклад, активність Са-АТФ-ази саркоплазматичного ретикулюму повільних скелетних м'язів, серця та гладких м'язів пригнічується під впливом білка фосфоламбану – доти, поки цей білок перебуває на насосі, іони Са 2+ не видалятимуться з цитоплазми в ретикулюм. Навпаки, активність Са-АТФ-ази плазматичної мембрани скелетних м'язів та нейронів зростає лише в тому випадку, якщо на молекулі насоса займе своє місце кальмодулін.

Важливо відзначити, що активність іонних насосів регулюється також за участю внутрішньоклітинних посередників – цАМФ, цГМФ, інозитолтрифосфату, діацилгліцеролу, іонів Са 2+ . Дія багато-

гіх речовин на збудливі клітини, особливо, що реалізується за участю клітинних рецепторів, багато в чому пов'язано з опосередкованим впливом на активність іонних насосів за рахунок зазначених внутрішньоклітинних посередників. Нижче розглядаються докладніше сучасні дані про іонні насоси.

Особливості роботи натрій-калієвого насоса. Натрій-калієвий насос, який є у всіх клітинах організму, працює як молекулярна машина з перекачування іонів Na+ і К+, тому її також називають як натрій-калієва помпа, або як Na+/K+- аденозинтрифосфатаза, що активується, або як «натрій -калієва АТФ-аза» (фермент). Натрій-калієвий насос був відкритий у дослідах з аксонами краба у 1957 році. датським дослідником Єнсом Крістіаном Скоу, за що він був удостоєний Нобелівської премії в 1997 році. Однак практичне застосування в медицині лікарських рослин, що блокують роботу насоса, зокрема наперстянки (Digitalis purpurea L.) і Digitalis lanata L.), зафіксовано у найдавніших текстах понад 1500 років тому і детально було описано у науковій статті 1785 року. (У. Вайтерінг), а ефективність їх застосування, зокрема за хронічної серцевої недостатності, нині науково обґрунтована.

За своєю будовою насос є складним білком, вбудованим у зовнішню мембрану клітини. Він складається з двох поліпептидних ланцюгів: більшого (альфа-субодиниця) і меншого (бета-субодиниця). У ряді випадків до них приєднується гамма-субодиниця.

Альфа-субодиниця являє собою пептидний ланцюг (110 кДа), що складається з 1021-1023 амінокислотних залишків. Вона багаторазово перетинає мембрану, утворюючи у зовнішньому середовищі та в цитозолі кілька петель. У ланцюзі виділяють 10 фрагментів (Ml - М10), що складаються з 17-25 амінокислотних залишків кожен. Вони розташовані усередині мембрани.Альфа-субодиниця містить активний центр зв'язування АТФ, який звернений до цитоплазми, а також центри зв'язування іонів Na+ і К + (розташовані в петлі між М2 і М3 фрагментами) і центр зв'язування ендогенних інгібіторів насоса, або уабаїн-зв'язуючий центр, який знаходиться в « шпильці» між М5 та Мб фрагментами.

Бета-субодиниця - це глікопротеїд, що виконує функцію лектину, т.е. е. білка, що впізнає. Бета-субодиниця не бере безпосередньої участі в роботі насоса, але, будучи нековалентно пов'язана з альфа-субодиницею, вона регулює її спорідненість до іонів Na+ і К+ і (як лектин) визначає просторове розташування альфа-субодиниці, докируя її положення в мембрані. Вона також виконають роль шаперона («няньки)» для альфа-субодиниці, т.е. е. сприяє формуванню її третинної структури. У процесі білкового синтезу обидві субодиниці вбудовуються в мембрану одночасно, при цьому бета-субодиниця забезпечує правильну орієнтацію альфа-субодиниці в мембрані. При гідролізі АТФ кілька протомерів можуть поєднуватися в олігомерні ансамблі, що підвищує швидкість функціонування насоса.

У клітинах виявляється також гамма-субодиниця. Вона приєднується до насоса і регулює його спорідненість з іонами Na + і К+, а також зв'язок насоса з іншими структурами клітини, наприклад, з натрій-кальцієвим обмінником.

Існує кілька видів ізоферментів, що відрізняються за будовою альфа-субодиниці (4 ізоформи) та бета-субодиниці (3 ізоформи), кожна з яких кодується відповідним геном. Ізоформи відрізняються між собою за багатьма показниками, у тому числі за чутливістю до уабаїну як інгібітору насоса.При цьому альфа 1-ізоформа виявлена ​​у всіх клітинах і є переважною у всіх сегментах нирок; альфа2-ізоформа представлена ​​в ЦНС, у шлуночках серця та скелетних м'язах; альфаЗ-ізоформа зустрічається в основному в мозку, а альфа4-ізоформа виявлена ​​лише в сім'яниках. Бета1-ізоформа зустрічається у всіх типах клітин тварин, бета2-ізоформа характерна головним чином для нервової тканини та скелетних м'язів, а бетаЗ-ізоформа виявляється у тканинах сім'яників, печінки та легень.

Наявність ізоформ певною мірою пояснює суттєві відмінності в характері електричної активності нейронів, скелетних м'язів, гладких м'язів та серцевого м'яза.

Механізм роботи насосу. Каталітичний цикл Іа,К-АТФ-ази починається із зв'язування з ферментом трьох іонів Na+ з цитоплазматичної сторони мембрани. Цей конформаційний стан ферменту зветься Е1 (Na-конформер), воно характеризується високою спорідненістю до АТФ, до іонів Na+ та АТФ-азної активності.

Цикл починається зі зв'язування трьох іонів Na +. Це відбувається в іонному центрі ферменту, розташованому в петлі між М2 і МЗ-фрагментами ферменту. Зв'язування відбувається завдяки координаційним зв'язкам іонів з атомами кисню, що належать дикарбоновим амінокислотам білка — аспарагінової та глутамінової (кисень утворює своєрідну решітку, в яку вписується або три гідратовані іони Na ​​+ , або два гідратовані іони К + . Після зв'язування всіх + ферменту, тобто.зростає його АТФ-азна активність, внаслідок чого відбувається гідроліз АТФ з вивільненням енергії, яка передається на фермент у вигляді перенесення фосфатної групи (Р) на залишок аспарагінової кислоти (Asp 369 ) активного центру альфа-субодиниці ферменту. Внаслідок цього утворюється інтермедіат El-Р, а АДФ вивільняється з активного центру та повертається до цитоплазми. При цьому фосфорильований фермент переходить у такий стан, коли іони Na ​​+ не спо-

собны вивільнятися ні цитоплазму, ні позаклітинний простір, т. е. вони окклюдированы в мембрані.

Потім під впливом іонів Mg 2+ фермент перетворюється на новий конформаційний стан Е2 (конформер Е2, чи К + -конформер), у якому молекула змінює свою орієнтацію у просторі і іони Na ​​+ опиняються на зовнішній стороні мембрани. У цьому стані фермент втрачає спорідненість до іонів Na+ і набуває високої спорідненості до іонів К+. Всі три іони Na ​​+ залишають фермент і йдуть у позаклітинне середовище, а «вільні» місця займають два позаклітинні іони К + .

Зв'язування двох іонів К+ активує процес дефосфорилювання, тобто звільнення ферменту від неорганічного фосфату. Це спричиняє нову конформаційну зміну ферменту, в результаті якого оклюдовані іони К+ виявляються на цитоплазматичній стороні мембрани (конформер Е2 перетворюється на конформер Е1). У такому положенні фермент втрачає високу спорідненість до іонів К+, але знову набуває високої спорідненості до іонів Na + . Два іони К+, залишаючи фермент, йдуть у цитоплазму, а «вільні» місця займають чергові три іони Na+. Таким чином, за один цикл клітина, витрачаючи енергію, що утворюється при гідроліз однієї молекули АТФ, активно (тобто.проти градієнта концентрації) відкачує три катіони Na ​​+, але вкачує натомість лише два катіони К +.

В результаті такого обміну (протипорт) сумарна кількість катіонів у клітці зменшується на один катіон, що підвищує мембранний потенціал, т.е. е. різниця зарядів між зовнішньою та внутрішньою поверхнею плазматичної мембрани. Такий режим роботи насоса називається електрогенним, і ми зобов'язані можливістю жити.

Завдяки роботі насоса у позаклітинному середовищі створюється висока концентрація іонів Na+, а всередині клітини – висока концентрація К+. Співвідношення 3: 2 пояснюється особливістю гідратування іонів Na + і К +. Справа в тому, що іони Na+ здатні легко утворювати гідрофільну оболонку, а іони К+ виявляють гідрофобність. До речі, за цією ознакою білкові молекули здатні розрізняти іони Na+ та К+ у водних розчинах. Підраховано, що за одну хвилину відбувається 7—10 тисяч циклів. При цьому, наприклад, у ЦНС на роботу Na+/K+ насоса витрачається до 30 % від усієї енергії, що споживається нейронами та гліальними клітинами ЦНС у стані неспання та уві сні.

В даний час при використанні різних методик (наприклад, виміри зміни власної триптофанової флуоресценції насоса або флуоресцентних міток) доведено, що під час кожного циклу дійсно відбуваються конформаційні зміни в молекулі ферменту (насоса), т.е. е. відбувається перетворення хімічної енергії АТФ на конформаційну (механічну) енергію.

Роль Na + / K + насоса для діяльності клітин величезна. Насос створює основу для формування мембранного потенціалу та здатності до генерації потенціалу дії, забезпечує здатність клітин-пейсмекерів (водіїв ритму) спонтанно генерувати потенціал дії. е.Продати якість автоматії. Завдяки насосу здійснюється осморегуляція, збереження клітинного об'єму, регуляція вмісту в організмі води та іонів Na+. Діяльність насоса є основою реалізації вторинно-активного транспорту, т.к. е. перенесення речовин (амінокислот, цукрів, нуклеотидів) через мембрану із середовища в цитозоль, що здійснюється за участю іонів Na+. Таке перенесення можливе завдяки створенню (за участю Na + /K+ насоса) концентраційного градієнта для іонів Na + . Робота насоса забезпечує високу концентрацію іонів К+ у цитозолі, що необхідно не тільки для формування мембранного потенціалу, але також для синтезу білка, гліколізу та інших процесів, що здійснюються в цитозолі.

Встановлено, що насос виступає в ролі рецептора ендогенних кардіотонічних стероїдів (уабаїну, маринобуфагеніну - при взаємодії цих речовин з рецептором може відбуватися активація різних сигнальних шляхів, в яких беруть участь інозитолтрифосфат, фосфоінозитол-3-кінази, тино МАРК, ERK1/2), що у результаті викликає або проліферацію клітин, або її смерть (апоптоз).

Регулюється активність Na+/K+ насоса багатьма факторами. Серед них:

• • фактори короткострокової регуляції – співвідношення іонів Na та К;
• • доступність АТФ;
• • вміст ліпідів у мембрані (наприклад, вільних жирних кислот, що знижують активність насоса);
• • компоненти цитоскелета (спектрин, актин, аддуцин, пасин, анкірін), що підвищують активність насоса;
• • активовані протеїнкінази (ПКА, ПКС, I1KG, тироїзинкінази), які, фосфорилуючи насос, знижують його активність;
• • фосфатази, які здійснюють дефосфорилювання насоса;
• • глутатіонілювання цистеїнових залишків насоса, т.е. е. приєднання до цистеїнових залишків глутатіону, т.е. е. основного внутрішньоклітинного антиоксиданту (це пригнічує насос, що дозволяє економити запаси АТФ в клітині в умовах окислювального стресу).

Є також фактори довгострокової регуляції, які змінюють інтенсивність синтезу альфа- та бета-субодиниць насоса (наприклад, альдостерон, що підвищує синтез насоса в епітелії нирок).

В організмі людини та тварин є ендогенні глікозиди (дигіталіс-подібні речовини, ендогенні кардіотонічні стероїди), які блокують роботу насоса. Це уабаїн (строфантин G), виділений із плазми крові у 1991 р. Він відноситься до класу карденолідів і продукується в головному мозку, головним чином у гіпокампі та супраоптичному ядрі гіпоталамуса.

Крім уабаїну, є ще одна група ендогенних кардіотонічних стероїдів (маринобуфагенін, телоцинобуфагін, буфалін та інші стероїди), які синтезуються в корі надниркових залоз з холестерину. За своєю природою вони відносяться до класу буфадієнолідів. Показано, що їхня продукція зростає під впливом уабаїну, що обумовлено активацією ренін-ангіотензинової системи.

Серед кардіотоніків наднирникового походження найбільш важливим та детально вивченим є маринобуфагенін, виділений у 1998 році. Для кардіотоніків, що продукуються у надниркових залозах, у тому числі для маринобуфагеніну характерний виражений вазоконстрикторний ефект, що може бути причиною підвищеного артеріального тиску (гіпертензії). Вважають, що ця особливість маринобуфагеніну лежить в основі прееклампсії - частого ускладнення вагітності, при якому зростає артеріальний тиск.Показано, що антитіла проти цього стероїду дають добрий клінічний ефект.

Механізм дії інгібіторів Na+/K+ насоса (серцевих глікозидів, уабаїну, стероїдних кардіотоніків) пояснюється тим, що блокатор (наприклад, уабаїн) взаємодіє з уабаїнзв'язуючим центром насоса, який знаходиться в «шпильці», розташованої між фрагментами М5. «Шпилька» складається з 21 амінокислотного залишку, серед яких ключову роль у зв'язуванні інгібіторів відіграють Phe 783, Thr 797 та Asp 804. Внаслідок зв'язування сегмент М4 змінює своє просторове положення таким чином, що блокує роботу насоса.

Останнім часом ендогенним кардіотонічним стероїдам надають велике значення, оскільки показано, що крім блокування Na + / K + насоса ендогенні глікозиди активують ряд сигнальних шляхів, у тому числі що індукують гіпертрофію міокарда, а також блокують розвиток пухлинного процесу.

Крім екзогенних та ендогенних глікозидів блокаторами Na+/К+ насоса, локалізованого в нирковому епітелії, є мозковий та передсердний натрійуретичні пептиди, про які детально повідомляється у розділі «Нейропептиди». Наявність множинних шляхів регуляції Na+/K+ насоса свідчить про його ключову роль життєдіяльності клітини.

Необоротне блокування насоса, небезпечне для життя, надають дихальні отрути (наприклад, ціаністий калій), що повністю інгібують окисне фосфорилювання в мітохондріях, внаслідок чого припиняється синтез АТФ, у зв'язку з чим відбувається загибель клітин і в першу чергу нейронів.

Вторинно-активний транспорт. Цей вид транспорту в основному представлений в ентероцитах (епітеліальні клітини кишечника) та в епітелії нирок.Суть його полягає у наступному (з прикладу перенесення молекули глюкози). Молекула глюкози повинна увійти до клітини, де її концентрація набагато вища, ніж у середовищі. Для того, щоб це сталося, необхідні витрати енергії. Але витрачається енергія, яка раніше була витрачена на перенесення іонів Na+. Річ у тім, що у цій клітині з допомогою роботи Na-насоса створюються низькі концентрації іонів Na+. За наявності високих концентрацій іонів Na + у середовищі цей іон прагнутиме увійти у клітину (за градієнтом) .

Отже, молекула глюкози приєднується до специфічного переносника, якого також приєднується іон Na+. В результаті градієнта концентрації (для іонів Na+) цей «комбайн» (переносник + глюкоза + іон Na + ) переноситься всередину клітини, де глюкоза та іон Na + відщеплюються від переносника, а переносник «іде» знову виконувати свою роботу. Іони Na ​​+ відкачуються з клітини Na-насосом, а молекула глюкози при необхідності може залишити клітину за градієнтом концентрації за рахунок механізму полегшеної дифузії, т.е. е. за участю спеціального переносника.

Наведені приклади демонструють наявність у живих системах котранспорту, коли одним механізмом транспортується одночасно дві молекули. У випадку Na-K-насоса має місце антипорт (потік іонів К+ спрямований всередину клітини, потік іонів Na+ спрямований із клітини в середу). У разі вторинно-активного транспорту має місце симпорт (потоки іонів Na + і молекул глюкози спрямовані всередину клітини).

Ендоцитоз, екзоцитоз та трансцитоз. Це варіанти активного транспорту, у яких змінюється архітектура мембран. Вони здійснюються із витратою енергії.

Ендоцитоз - Це процес активного введення великомолекулярних частинок з середовища в клітину.Такий вид транспорту, наприклад, має місце у новонароджених дітей, які з молоком матері отримують антитіла (імуноглобуліни). Ці великі білкові частинки не руйнуючись, за допомогою ентероцитів всмоктуються в кишечнику і потрапляють у кров дитини, будучи абсолютно непорушеними та здатними до виконання своїх функцій.

Механізм ендоцитозу ось у чому. Матеріал, що знаходиться у позаклітинному просторі, захоплюється в області випинання (інвагінації) плазмолеми, краї якого стуляються з формуванням ендоцитозної бульбашки, або ендосоми, - дрібного сферичного утворення, герметично оточеного мембраною. Будучи захопленою клітиною, ендосома та її вміст піддається внутрішньоклітинній переробці, або процесингу. Різновидами ендоцитозу є піноцитоз і фагоцитоз.

Піноцитоз - це захоплення та поглинання клітиною рідини та (або) розчинних речовин. Піноцитоз поділяється на макропіноцитоз (діаметр ендосом 0,2-0,3 мкм) та мікропіноцитоз (діаметр ендосом - 70-100 мкм).

Фагоцитоз - це захоплення та поглинання клітиною щільних, великих (розміром більше 1 мкм) частинок. Зазвичай цей процес супроводжується утворенням випнувань цитоплазми - псевдоподій, що охоплюють об'єкт фагоцитозу і змикаються над ним.

Різновидом ендоцитозу є рецепторно-опосередкований ендоцитоз. Справа в тому, що ефективність ендоцитозу може суттєво збільшитися, якщо ендоцитоз (зокрема фагоцитоз) реалізується за участю мембранних рецепторів, що знаходяться на клітинах-фагоцитах. Ці рецептори можуть зв'язуватися з лігандами, що знаходяться на поверхні об'єкта, що фагоцитується.

Прикладом рецепторно-опосередкованої взаємодії може бути фагоцитоз бактерій, який робить нейтрофіл.Якщо на поверхні бактерії знаходяться антитіла (імуноглобуліни проти даного мікроба), то за рахунок рецепторів до цих антитіл нейтрофіл більш активно піддаватиме фагоцитозу бактерію. Процес полегшення фагоцитозу у разі носить назву опсонизация.

Екзоцитоз - Це виділення великих молекул із клітини. Приклад тому — виділення квантів медіатора із везикули у синапсі. По суті, екзоцитоз є процесом, зворотним до ендоцитозу. При екзоцитозі спочатку відбувається упаковка речовини, що транспортується, в мембранні екзоцитозні бульбашки. Після того, як такі структури сформувалися, вони наближаються до плазмолем і зливаються з нею. При цьому мембрана бульбашки вбудовується в плазмолемму, а вміст бульбашок (продукти власного синтезу клітини або молекули, що транспортуються нею, неперетравлені, шкідливі речовини та ін) виділяються в позаклітинний простір.

Виділені речовини можуть:

• 1) прикріплюватися до клітинної поверхні;
• 2) ставати периферичними білками (наприклад антигенами);
• 3) увійти до складу міжклітинної речовини (наприклад, колаген та глікозаміноглікани);
• 4) потрапляючи у позаклітинну рідину, можуть виконувати роль сигнальних молекул (гормони, цитокіни, медіатори).

Трансцитоз спостерігається в тих клітинах, у яких на одній поверхні клітини формується ендоцитозний пухирець, який переноситься до протилежної поверхні клітини і, стаючи экзоцитозною бульбашкою, виділяє свій вміст у позаклітинний простір. Трансцитоз характерний насамперед для ендотеліальних клітин кровоносних судин. У цих клітинах бульбашки можуть об'єднуватися, утворюючи тимчасові трансцелюлярні канали, якими транспортуються водорозчинні молекули.

В останні роки показано, що утворення ендоцитозних та екзоцитозних бульбашок полегшується особливими так званими фузогенними (що сприяють злиттю) мембранними білками, які концентруються в ділянках інвагінації плазмолеми. Важливу роль у процесах ендоцитозу та екзоцитозу відіграють елементи цитоскелету, зокрема мікрофіламенти та мікротрубочки. Процес ендоцитозу та екзоцитозу зазвичай врівноважений, тому не відбувається виснаження запасів мембрани. Цей процес отримав назву "мембранного конвеєра".