IX Міжнародна студентська наукова конференція Студентський науковий форум – 2017

Почнемо із того, як виглядає молекула ДНК. Молекули полімерів характеризуються первинної структурою, під якою розуміється просто склад молекули (у разі – послідовність букв A, C, G і T, які й становлять геном), вторинної структурою, тобто. тим, які саме хімічні зв'язки встановлюються між цими компонентами і які у результаті виходять базові просторові структури (у разі – подвійна спіраль), і третинної структурою, тобто. тим, як вторинна структура «покладена» у просторі. Вторинна структура ДНК є подвійною спіралью, що складається з чотирьох різних нуклеотидів. Нуклеотиди позначаються по азотистих підставах, що містяться в них: аденіну (A), цитозину (C), гуаніну (G) і тиміну (T) (є ще урацил, який в РНК замінює тімін), і надалі ми завжди будемо користуватися цими літерами. У подвійній спіралі ці амінокислоти пов'язані один з одним водневими зв'язками, і зв'язок встановлюється за принципом комплементарності: якщо в одній нитці ДНК стоїть A, то комплементарної нитки буде T, а якщо в одній нитці C, то в іншій буде G. Саме це дозволяє щодо просто проводити реплікацію (копіювання) ДНК, наприклад, при розподілі клітини: для цього досить просто розірвати водневі зв'язки, розділивши подвійну спіраль на нитки, після чого парна нитка для кожного "нащадка" автоматично збереться правильно.

Секвенування ДНК - визначення амінокислотної чи нуклеотидної послідовності ДНК. В результаті секвенування одержують формальний опис первинної структури лінійної макромолекули у вигляді послідовності мономерів у текстовому вигляді.Розміри ділянок ДНК, що секвенуються, зазвичай не перевищують 100 пар нуклеотидів і 1000 пар нуклеотидів при секвенуванні за Сенгером. В результаті секвенування ділянок ДНК, що перекриваються, отримують послідовності ділянок генів, цілих генів, тотальної мРНК і навіть повних геномів організмів. [1]

1. ТРАДИЦІЙНІ МЕТОДИ СЕКВЕНУВАННЯ

1.1. Метод Едмана.

Метод Едмана - один із ранніх методів секвенування. Розроблено у 1950—1956 роках шведським біохіміком Пером Віктором Едманом. Суть методу полягає в обробці пептиду досліджуваного певним набором реагентів, що призводить до відщеплення однієї амінокислоти з N-кінця послідовності. Циклічне повторення реакції та аналіз продуктів реакцій дають інформацію про послідовність амінокислот у пептиді. Метод Едмана був поширений у другій половині ХХ століття. В даний час практично не застосовується через багато властивих йому недоліків (кількісне протікання реакції, множинні побічні процеси).

ФІТЦ (фенілізотіоціанат) - реагент, що використовується для визначення N-кінцевої амінокислоти в пептиді. Він здатний реагувати з альфа-амінокислотами та альфа-карбоксильною групою вільних амінокислот. В результаті взаємодії з N-кінцевою амінокислотою поліпептиду утворюється фенілтіогідантіонове похідне, в якому дестабілізовано зв'язок між альфа-карбоксильною групою N-кінцевої амінокислоти в пептиді. Цей зв'язок вибірково гідролізується без ушкодження інших пептидних зв'язків. після реакції виділяють комплекс ФІТЦ з N-кінцевою амінокислотою, і ідентифікують його хроматографічним методом. Далі цей процес повторюють із укороченим пептидом. Таким чином отримують послідовність амінокислот у пептиді.

1.2. Метод Сенгера.

Дидезоксинуклеотидний метод, чи метод «обриву ланцюга», розробили Ф. Сенгера в 1977 році і в даний час широко використовується для визначення нуклеотидної послідовності ДНК. При секвенуванні по Сенгер відбувається гібридизація синтетичного олігонуклеотиду довжиною 17-20 ланок зі специфічною ділянкою одного з ланцюгів ділянки, що секвенується. Цей олігонуклеотид є праймером, що постачає 3'-гідроксильну групу для ініціації синтезу ланцюга, комплементарної матриці.

Розчин з праймером розподіляють по чотирьох пробірках, у кожній з яких знаходяться чотири дезоксинуклеотиди, dATP, dCTP, dGTP і dTTP (один з них - мічений радіоактивним ізотопом) і один із чотирьох 2',3'-дидезоксинуклеотидів (ddATP, ddTTP, ddGTP або ddCTP). Дидезоксинуклеотид включається за всіма позиціями в суміші зростаючих ланцюгів, і після його приєднання зростання ланцюга відразу зупиняється.

В результаті цього в кожній із чотирьох пробірок за участю ДНК-полімерази утворюється унікальний набір олігонуклеотидів різної довжини, що включають праймерну послідовність. Далі в пробірки додають формамід для розбіжності ланцюгів і проводять електрофорез у поліакриламідному гелі на чотирьох доріжках. Проводять радіоавтографію, яка дозволяє «прочитати» нуклеотидну послідовність сегмента ДНК, що секвенується.

У сучасному варіанті дидезоксинуклеотиди мітять чотирма різними флуоресцентними барвниками і проводять ПЛР в одній пробірці. Потім під час електрофорезу поліакриламідному гелі промінь лазера в певному місці гелю збуджує флуоресценцію барвників, і детектор визначає, який нуклеотид зараз мігрує через гель. Сучасні пристрої використовують для секвенування ДНК капілярний електрофорез.

2.МЕТОДИ СЕКВЕНУВАННЯ НОВОГО ПОКОЛІННЯ

2.1. Піросеквенування

Піросеквенування - це метод секвенування ДНК (визначення послідовності нуклеотидів у молекулі ДНК), заснований на принципі "секвенування шляхом синтезу". При включенні нуклеотиду відбувається детекція пірофосфатів, що вивільняються. Технологія була розроблена Полом Ніреном та його студентом Мустафою Ронагі, у Королівському Технічному Інституті (Стокгольм) у 1996 році. [3]

Принцип методу досить простий і ґрунтується на (+/-)-секвенуванні, запропонованому ще в 60-х роках. При послідовному додаванні до ДНК-полімеразного комплексу дезоксинуклеозидтрифосфатів їх включення в нитку, що синтезується, залежить від нуклеотидної послідовності матриці. Полімеразний синтез ДНК супроводжується виділенням пірофосфату. Цей пірофосфат у присутності сульфурилази та аденозинфосфосульфату перетворюється на АТФ і запускає окислення люциферину люциферазою, що супроводжується біолюмінесценцією. Люмінесценція реєструється фоторозмножувачем або цифровою камерою.

Приладове оснащення, необхідне для проведення піросеквенування, спочатку не відрізнялося особливою складністю. У початковому варіанті, описаному Hyman, пропонувалося використовувати проточний капіляр, що містить кілька іммобілізованих ферментів та аналізовану ДНК. Компанія "Biotage AB" (Швеція) пропонує прилади для роботи з 96-лунковими планшетами. Реагенти вводяться в лунки головкою струминного принтера, після чого не видаляються, а розщеплюються спеціальним ферментом – апіразою.

Істотною особливістю складнішої технології, розробленої компанією "454 Life Sciences", є використання емульсійної ПЛР для одночасної паралельної підготовки сотень тисяч препаратів ДНК до секвенування.

Така пробопідготовка складається з наступних етапів:

• Ультразвукова фрагментація (небулізація) аналізованої ДНК;
• Пришиття адапторів та денатурація ДНК;
• Одержання емульсії, що містить у мікрокраплях поодинокі фрагменти ДНК та полістирольні кульки з пришитим праймером;
• Проведення емульсійної ПЛР (emPCR);
• Відмивання мікрокульок від реагентів та видалення незв'язаних з кульками ниток ДНК;
• Завантаження кульок у лунки проточної камери;
• Завантаження лунок мікрокульками із іммобілізованими ферментами.

Піросеквенатор "454 Life Sciences" складається з комплекту пляшок з реагентами, керованого комп'ютером багатоканального насоса, проточного осередку та чутливої ​​цифрової фотокамери.

При пропущенні реагентів через проточну комірку реєструються люмінесцентні сигнали, що випромінюються сотнями тисяч мікролунок. протяжними нуклеотидними повторами.

Протяжність ділянок ДНК, що секвенуються, може перевищувати 100 основ.

Недоліки даної технології: в ранніх експериментах дАТФ давав високе фонове свічення. Причиною могли бути або домішки АТФ, або недостатньо висока специфічність люциферази. цього фосфотіоату.

Ще одна проблема – велика витрата розчинів, що пропускаються через проточний осередок.Високі вимоги до чистоти dNTP обумовлені ще й тим, що в їх розчинах через спонтанний гідроліз високоенергетичних зв'язків може накопичуватися пірофосфат.

Крім того, якщо викидати всі розчини після їх прокачування через проточний осередок, то вартість такого секвенування буде непомірно висока. перед їх використанням та про обов'язкову реутилізацію всіх відпрацьованих розчинів.

Таким чином, зараз існують деякі обмеження застосування цього способу секвенування Лімітуючим фактором є довжина послідовності нуклеотидів, яка становить близько 300-500 нуклеотидів, що коротше, ніж 800-1000 нуклеотидів, досяжні методом обриву ланцюга (наприклад, метод Сен). Такі обмеження можуть ускладнювати секвенування геномів, зокрема, багатих повтореними послідовностями нуклеотидів.

2.2.

Це метод секвенування нового покоління, розроблений Solexa.

В основі методу лежить принцип секвенування шляхом синтезу:

• Одноланцюгові фрагменти ДНК закріплюються на твердій підкладці.
• ДНК-залежна ДНК полімераза синтезує комплементарний ланцюг.
• Вбудовування кожного нового нуклеотиду реєструється камерою.

У методі Solexa використовуються 3'-модифіковані нуклеотиди з приєднаними флюоресцентними мітками різних кольорів. Модифікація нуклеотидів не дозволяє ДНК-полімеразі приєднати більше одного нуклеотиду. Флюоресценція ініціюється коротким імпульсом лазера і тип приєднаного нуклеотиду визначається кольором флюоресцентної мітки. Модифікація нуклеотиду блокується (полімераза може рухатися далі) і цикл повторюється знову. В результаті вдається визначити послідовність ДНК завдовжки до 250 нуклеотидів. Таку послідовність ДНК називають прочитанням або рідом (калька з англійської).

Перший секвенатор Genome Analyzer 1G був представлений компанією Solexa у 2006 році. Довжина прочитання становила 30-35 нуклеотидів, можна було отримати близько 1 Gb інформації. HiSeq 2000 (2011 рік) здатний секвенувати 6 людських геномів за 11 днів. Довжина прочитання складає 100 нуклеотидів, можна отримати 600 Гб інформації.

Принцип методу:

1. Підготовка ДНК. Досліджувана дволанцюжкова ДНК фрагментується. До дволанцюгових фрагментів за допомогою ДНК-лігази пришивається невеликий ДНК-фрагмент - адаптер. Адаптер складається із двох олігонуклеотидів, частково комплементарних один одному. При змішуванні таких олігонуклеотидів утворюється "вилка", "ніжка" якої складається з дволанцюгової ДНК (там де олігонуклеотиди комплементарні), дві "ручки" складаються з одноланцюгової ДНК. Лігаза пришиває два адаптери за «ніжку» до кожного кінця досліджуваного фрагмента ДНК.
2. Далі відбувається ампліфікація одержаних фрагментів ДНК за допомогою ПЛР. В результаті утворюється безліч фрагментів дволанцюгової ДНК, на одному кінці перший олігонуклеотид, що становить адаптер, на іншому кінці другий.

• Підготовка осередку (flowcell).

Комірка містить усередині 8 доріжок. У кожній доріжці може секвенуватися окремий зразок. місткової ампліфікації. з олігонуклеотидів є сайт для рестриктази.

Виробляють плавлення досліджуваної ДНК і вже одноланцюгові її фрагменти відпалюються на закріплених на підкладці праймерах.

1. У систему додається все необхідне ПЛР, крім праймерів.
2. Полімераза добудовує комплементарний ланцюг. Тепер кожен досліджуваний фрагмент виглядає як дволанцюжкова ДНК, кінець одного з ланцюгів пришитий до поверхні осередку.
3. Проводиться плавлення дволанцюжкової ДНК, в результаті якого комплементарні ланцюги ДНК розходяться.
4. Своїм незакріпленим кінцем ланцюг ДНК може утворити комплементарну взаємодію з другим іммобілізованим олігонуклеотидом.
5. Полімераза знову добудовує комплементарний ланцюг, використовуючи як праймер другий олігонуклеотид.
6. Після плавлення та видалення незакріплених ланцюгів ДНК фрагмент виглядає як дві одноланцюгові ДНК, прикріплені до поверхні.Вільний кінець кожного з ланцюгів може утворити місток з іммобілізованим олігонуклеотидом. Далі повторюються пункти 6 та 7.
7. Після ампліфікації навколо кожного закріпленого фрагмента з'являється велика кількість його копій. Половина з копій розташована «нагору ногами». Додається рестриктаза, яка розщеплює один із прикріплених олігонуклеотидів — непотрібні копії вимиваються. Тепер всі копії ДНК, отримані в результаті ампліфікації початкового фрагмента, розташовані однаково.

• Секвенування.

1. ДНК-залежна ДНК полімераза синтезує комплементарний ланцюг. Вбудовування кожного нового нуклеотиду реєструється камерою. У систему додаються праймери та ДНК-полімераза.
2. В систему додаються 3'-O-азидометил 2'-деоксинуклеозид трифосфати (A, C, G і T), кожен з флюоресцентною відмітною свого кольору. Наявність 3'-O-азидометилу не дозволяє ДНК-полімеразі приєднати більше одного нуклеотиду. Полімераза приєднує один модифікований нуклеотид, нуклеотиди, що залишилися, вимиваються.
3. Осередок висвітлюється коротким імпульсом лазера. Приєднаний флюорофор світиться своїм кольором. Оскільки після ампліфікації навколо кожної молекули ДНК є безліч її копій, світло множини однакових флюорофорів можна зареєструвати.
4. В систему додається речовина (TCEP), через яку флюорофор та азидометил відокремлюються та вимиваються. 3′-гідроксильна група стає доступною для приєднання ще одного нуклеотиду.
5. Повторюються пункти 2-5.

Переваги та недоліки методу:

Порівняно з іншими методами секвенування нового покоління, метод Illumina є найбільш високопродуктивним — 600 Gb за одне прочитання.Отже вартість секвенування на 1 Gb інформації буде невелика. До позитивних особливостей можна віднести і точність при невеликій довжині прочитання.

Більшість помилок секвенування, що виникають, — неправильне визначення приєднаного нуклеотиду. Середня частота помилок становить 0,5% - одна помилка для прочитання довжиною 200 нуклеотидів. До недоліків можна віднести високу вартість приладів та невелику довжину прочитань (до 250 нуклеотидів). [5]

Висновок

Одна з найбільш фундаментальних розробок, створених для вивчення генетики, секвенування ДНК дозволяє вченим знайти послідовність нуклеотидів у фрагментах ДНК. З цією технологією дослідники змогли вивчати молекулярні послідовності, пов'язані з багатьма захворюваннями людини і багатьма іншими проблемами.

Повне секвенування геному у поєднанні із застосуванням методів генетичної інженерії робить свій внесок у багато сфер наукової діяльності.

Список литературы:

1. Геноміка: постановка задачі та методи секвенування [Електронний ресурс]

1. Піросеквенування (аналітичний огляд) [Електронний ресурс] URL: http://molbiol.ru/bio/001/001
2. Метод Illumina/Solexa [Електронний ресурс]

Секвенування NGS

NGS або next generation sequencing — секвенування нового покоління. Термін означає визначення нуклеотидної послідовності (дослідження первинної структури) ДНК чи РНК. Секвенувати можна й інші біополімерні молекули, наприклад білки, але в цій статті йтиметься тільки про нуклеїнові кислоти. Нині застосовується кілька варіантів методу. Один із найпоширеніших — секвенування за Сенгером.Перевагою є висока точність та відносно низька вартість при дослідженні невеликих фрагментів ДНК. Недоліком є ​​низька пропускна спроможність та дорожнеча для дослідження великого обсягу даних. Саме ці мінуси стали основою для розробки та впровадження сучаснішої технології — NGS.

Скринінг на 32 часті мутації, що призводять до 18 важких спадкових захворювань. Особливість даного тесту полягає в тому, що мутації для скринінгу були відібрані в результаті аналізу даних секвенування понад 15 000 жителів Росії. Таким чином, досліджуються саме ті варіанти, ймовірність виявлення яких у росіян найбільш висока.

Особливості NGS

• підготовка бібліотек;
• сіквенс;
• аналіз даних.

• зниження вартості дослідження;
• автоматизація аналізу;
• великий обсяг отриманої інформації.

Методи NGS мають більшу продуктивність, що дозволяють виконувати одночасне зчитування мільярдів коротких фрагментів нуклеїнових кислот. Крім того, NGS дає можливість проводити секвенування відразу кількох десятків геномів за один запуск аналізатора.

Види NGS

Технологія секвенування наступного покоління може бути реалізована на основі наступних методів:

1. Піросеквенування - засноване на реєстрації пірофосфату, що утворюється під час мобілізації чергового нуклеотиду на матрицю ДНК. Реєстрація пірофосфату проводиться у вигляді каскаду хімічних реакцій, наприкінці якого виділяється квант світла.
2. Секвенування на молекулярних кластерах також відбувається з урахуванням синтезу нової молекули ДНК виходячи з матриці. Вона кріпиться на поверхні проточного осередку, а детекція здійснюється за допомогою флуоресцентної мітки нуклеотидів.
3. Технічне лігазне секвенування, на відміну від попередніх методів, використовує утворення хімічних зв'язків між нуклеотидами за допомогою лігази. Клональна бібліотека наноситься на магнітні сфери і поміщається у проточну комірку. Послідовність нуклеотидів визначається за допомогою флуоресцентної мітки, що відщеплюється.
4. Іонне напівпровідникове секвенування ґрунтується на використанні напівпровідникових мікрочіпів. У момент подовження синтезованого ланцюга на один нуклеотид відбувається зміна рН на мікрочіпі. Воно реєструється, таким чином визначається послідовність нуклеотидів.
5. Одномолекулярне секвенування відноситься до методів третього покоління. Воно дозволило відмовитися від полімеразної ланцюгової реакції на етапі пробопідготовки і дає можливість стежити за нарощуванням ланцюга, що синтезується, в режимі реального часу.

Клінічне секвенування екзома - це тест визначення генетичних варіантів у всіх відомих клінічно значущих генах. Він дозволяє миттєво провести пошук патогенних варіантів, пов'язаних практично з усіма відомими моногенними захворюваннями. При цьому відсутні надмірні та клінічно неінформативні дані, що спрощує інтерпретацію та знижує вартість дослідження.

Області застосування NGS

• Секвенування геному de novo - розшифрування раніше невивченого геному. Використовується в бактеріології, вірусології та ін.
• Повногеномне ресеквенування.
• Спрямоване ресеквенування генів, про які відомо, що наявність у них мутації призводить до розвитку захворювання.
• Секвенування РНК проводиться для оцінки експресії генів. При цьому можна оцінювати як кодуючі, так і регуляторні РНК.
• Метагеномне секвенування - дозволяє визначити склад організмів у досліджуваному зразку, наприклад, у матеріалі, взятому з кишечника або ротової порожнини.

У медико-генетичному центрі «Геномед» є сучасне обладнання та кваліфікований персонал для проведення секвенування методом NGS.

Секвенирование одного клінічно значущого гена - це тест визначення генетичних видів в одному клінічно значущому гені. Він дозволяє миттєво провести пошук патогенних варіантів у екзонах одного гена.

ДНК-тест

Соматичні мутації у пухлини

Навіщо здоровим людям генетичні випробування?

Що таке преімплантаційне генетичне тестування

Натискаючи кнопку, ви даєте згоду на обробку персональних даних

Виберіть зручний
спосіб зв'язку

Натискаючи кнопку, ви даєте згоду на обробку персональних даних

Ми пишаємося тим, що є лідерами у галузі генетичних досліджень. Раді запросити талановитих і амбітних людей до нашої команди, давайте об'єднаємо наші зусилля і досягнемо небувалих висот.

Ласкаво просимо до Геномеда!

• Клінічні поради
• Запитання-відповіді
• Ліцензія
• Правила надання платних мед. послуг
• Стандарти медичної допомоги
• Вищі організації
• Офіційний інтернет-портал правової інформації Російської Федерації
• Офіційний сайт Міністерства охорони здоров'я Російської Федерації

Виберіть своє місто

3035 3061 3034 3033 3026 2917 2762 2734 2752 2833 2834 2835 2836 2837 2838 2839 2840 2841 3098 4 2846 2847 2848 2849 2853 3109 2854 3110 2855 3111 2856 2857 2858 2859 2861 2862 2863 2864 2868 28 2871 2872 2873 2875 2876 2877 2878 2879 2880 2881 2882 2883 2885 2886 2887 2892 2894 2895 2898 28 2901 2902 2903 2904 2905 2951 2955 1678 1693 2749 2753 2754 2755 2756 2757 2758 2759 2760 2722 6 2769 2770 (будь-який вік)
вул. Б.Бікбая 29А (KDL)
(будь-який вік) ">2771 2772 2773 2774 2775 2776 2777 2778 2779 2780 2781 2782 2784 2785 2786 2787 2788 2789 27 2795 2798 2799 2800 2801 2802 2805 2807 2808

Виберіть зручний
спосіб зв'язку

Натискаючи кнопку, ви даєте згоду на обробку персональних даних

Виберіть зручний
спосіб зв'язку

Натискаючи кнопку, ви даєте згоду на обробку персональних даних

Виберіть зручний
спосіб зв'язку

Натискаючи кнопку, ви даєте згоду на обробку персональних даних

Виберіть зручний
спосіб зв'язку

Виберіть зручний
спосіб зв'язку

Виберіть зручний
спосіб зв'язку