Основні молекулярні генетичні механізми
Надспіралізація ДНК
Багато ДНК прокаріотів є кільцевими (циклічними). Кільцеві ДНК також спостерігаються в мітохондріях та хлоропластах еукаріотів.
Кожен із двох ланцюгів кільцевої молекули ДНК утворює замкнутий ланцюг без вільних кінців.
Локальне розплітання подвійної спіралі ДНК, яке відбувається в ході реплікації ДНК, індукує торсіонну напругу в частині молекули, що залишилася, оскільки в ній відсутні вільні кінці, які могли б, вільно обертаючись, зняти напругу.
В результаті кільцева молекула скручується, набуваючи надспіральної форми (supercoil) (рисунок 5(a)). Іншими словами, коли частина ДНК розплетена, інша частина виявляється надспіралізована.
Фермент топоізомеразу I, який міститься в клітинах, знімає подібну напругу, яка виникає в кільцевих ДНК при реплікації або інших процесах.
Топоізомераза I зв'язується з ДНК, розрізає один із фосфодіефірних зв'язків (що дозволяє надспіралізованій "скрученій" молекулі "розкрутитися"), відновлюючи релаксовану кільцеву форму (рисунок 5(6)), а потім "зшиває" розірваний ланцюг.
Інший фермент топоізомеразу II (інша назва, ДНК-гіраза), розрізає відразу два ланцюги кільцевої ДНК, а потім відновлює їх. В результаті топоізомераза II може як видаляти надспіралізацію, так і об'єднувати дві кільцеві ДНК, що перетинаються, в одну в точці їх перетину.
Малюнок 5 – Кільцеві ДНК: а – надспіралізована кільцева ковалентно замкнута ДНК; б - релаксація кільцевої ДНК при розрізанні однієї з ниток топоізомеразою I, яка потім відновлює замкнутість нитки
З функціональної точки зору важливо, що надспіралізована ДНК має значний запас енергії в порівнянні з її релаксованою формою. Цей запас енергії є "сигналом" для зв'язування з нею деяких білків (наприклад, топоізомераз).
Хоча ДНК еукаріотів не має кільцевої форми, але при конденсації ДНК у хромосому відбувається утворення петель та спіралізація хроматину. Тому в процесі деконденсації хроматину, реплікації та транскрипції ДНК також відбувається утворення торсіонних напруг та утворення надспіралей. Наявність топоізомерази I в ядрі еукаріотів дозволяє усувати такі торсіонні напруги.
Біологічна бібліотека – матеріали для студентів, вчителів, учнів та їх батьків.
Наш сайт не претендує на авторство розміщених матеріалів. Ми лише конвертуємо у зручний формат матеріали, які знаходяться у відкритому доступі та надіслані нашими відвідувачами.
Якщо ви володієте авторським правом на будь-який розміщений у нас матеріал і маєте намір видалити його або отримати посилання на місце комерційного розміщення матеріалів, зверніться для погодження до адміністратора сайту.
Дозволяється копіювати матеріали з обов'язковим гіпертекстовим посиланням на сайт, будьте вдячними ми витратили багато зусиль, щоб привести інформацію у зручний вигляд.
Який фермент розрізає ДНК?
Проривом у розробці молекулярного клонування стало відкриття на початку 1970-х років бактеріальних ендонуклеаз (рестриктаз) — ферментів, які розпізнають специфічні послідовності у подвійній спіралі ДНК та розщеплюють обидві нитки ДНК у місці (сайті) розпізнавання.Розриви можуть бути прямо протилежні один до одного, в цьому випадку вони залишають закінчені нитки ДНК, або можуть бути зміщені на кілька пар основ у будь-якому напрямку, що призводить до того, що один з кінців нитки ДНК нависає над іншим.
В даний час час відомо більше 3500 ферментів рестрикції, кожен зі своїм власним сайтом розпізнавання, що складається з чотирьох або шести пар основ, хоча кілька ферментів мають більш довгі сайти. Послідовність основ сайту зазвичай буває паліндромом, тобто. збігається під час читання як з 5', і з 3'-кінця нитки ДНК.
Наприклад, фермент рестрикції ЕсоRI розпізнає специфічну паліндромну послідовність із шести пар основ 5'-GAATTC-3, де б вони не знаходилися в подвійній молекулі ДНК.
Фермент розщеплює ДНК в цьому місці, зі зміщенням розривів у нитках ДНК у 4 пари основ між гуаніном та суміжним аденіном у послідовності GAATTC. При цьому утворюється два фрагменти, кожен з однонитковим закінченням з чотирьох основ 5'-ААТТ-3' в кінці.
Розщеплення молекули ДНК конкретним ферментом рестрикції розриває ДНК на характерний та відтворюваний набір фрагментів, розподіл довжин яких відображає частоту та позиції специфічних місць впливу ферменту. Наприклад, рестриктаза ЕсоRI розриває подвійну спіраль ДНК специфічно в послідовності 5'-GAATTC-3'.
Обробка ДНК всього генома людини ферментом ЕсоRI генерує набір приблизно з 1 млн. фрагментів змінної довжини, кожен з конкретною позицією в геномі. У середньому фермент із сайтом розпізнавання в 6 пар основ, подібно до ЕсоRI, повинен розщеплювати ДНК людини через кожні 46 пар основ, або кожні 4096 пар основ.Насправді такі місця не розподілені рівномірно через склад основ та його послідовності протягом геному.
Таким чином, ЕсоRI фрагментує ДНК на шматки розміром від десятка до багатьох сотень тисяч пар основ; довжина кожного фрагмента визначається тим, скільки ДНК знаходиться між двома послідовними сайтами розпізнавання ЕсоRI.
Оскільки всі молекули ДНК, оброблені ферментом ЕсоRI, незалежно від їх походження, мають ідентичні однониткові кінці, будь-які дві молекули ДНК, оброблені ЕсоRI, можуть бути з'єднані разом in vitro, шляхом спарювання комплементарних кінців, що містять 4 пари основ, за допомогою ферменту ДНК-лігази. Це створює рекомбінантну молекулу ДНК, один кінець якої походить з одного джерела, а другий від іншого.
Коли фермент рестрикції розрізає обидві нитки в одній і тій же позиції, залишаючи «тупі» кінці, ДНК-лігаза також може з'єднувати їх разом без необхідності в сумісності ниток, що «нависають».
Редактор: Іскандер Мілевскі. Дата поновлення публікації: 18.3.2021
- Ферменти рестрикції. Застосування у молекулярній генетиці
- Вектори плазміди у молекулярній генетиці. Що таке плазміда?
- Бібліотеки у молекулярній генетиці. Що таке бібліотека?
- Скринінг бібліотек гібридизаційними зондами у молекулярній генетиці. Особливості
- Саузерн-Блоттінг в молекулярній генетиці. Особливості
- Алель-специфічні олігонуклеотидні зонди у молекулярній генетиці. Особливості
- Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Особливості
- Молекулярний аналіз мутацій у людини. Рекомендації
- Аналіз послідовності ДНК. Особливості
- Методи аналізу зображень флюоресцентно мічених нуклеотидів. Особливості
Рестрикція ДНК
Рестрикція ДНК досягається за допомогою специфічних ферментів. рестриктаз. Вони є ендонуклеази бактеріального походження, призначені для захисту клітин бактерій від чужорідної (вірусної) ДНК. Рестриктази здатні здійснювати розриви міжнуклеотидних (фосфодіефірних) зв'язків усередині полінуклеотидних ланцюгів ДНК. Вперше рестриктази були виявлені у клітинах кишкової палички (Е. coli), заражених бактеріофагом X. При цьому виявилося, що фагове потомство, вирощене на двох різних штамах цієї бактерії, з різною інтенсивністю розмножується в протилежних клітинах штамів. Так, фаг, вирощений на штамі З погано розмножувався в клітинах бактерії штаму К12. Це обмеження розвитку (рестрикція) бактеріофага, як виявилось, пов'язане з ендонуклеазною деградацією його ДНК. Сама клітинна ДНК захищається від рестриктаз штаммоспецифічною модифікацією - метилюванням частини нуклеотидів, яке здійснюється спеціальним ферментом - ДНК-метилазою. Найчастіше продуктами метилювання є 6-метіладенін та 5-метилцитозин (див. тему 3).
- 1) назва рестриктази формується з родової та видової назви мікроорганізму-господаря, що містить R-M-систему; при цьому до першої великої літери родової назви додаються дві перші малі літери виду, наприклад: Escherichia coli - Eco, Haemophilus influenzae — Hin;
- 2) за родовидовою назвою, у разі потреби, наводиться позначення штаму (?з В) або серотипу (Hin d);
- 3) різні R-M-системи, властиві одному виду бактерій, позначаються римськими цифрами: Hind I, Hind II, Hind III;
- 4) якщо R-M-система локалізована в геномі плазміди, то після родовидової назви вказується символ плазміди: Eco RI.
Основою для класифікації рестриктаз є характер їх впливу на ДНК і залежність від кофакторів. Серед кількох тисяч відомих на цей час рестриктаз виділяють 3 класи (типу).
Рестриктази типу I містять три неідентичні субодиниці з мол. масами 135, 60 і 50 кДа (а, (3 і у) і масою епімолекули близько 500 кДа. Ці рестриктази специфічні до неметильованої дволанцюжкової ДНК і вимагають як кофакторів S-аденозилметіонін (донор метальних груп у реакції метилювання) Mg 2+.
Субодиниці рестриктаз типу I мають різні функції: а-субодиниці проводять розщеплення ДНК, (3-субодиниці здатні метилювати ДНК, у-субодиниці здійснюють впізнавання специфічних послідовностей ДНК.
У той же час розриви в ланцюгах ДНК під дією цих рестриктаз відбуваються випадковим чином на значній відстані від ділянки впізнавання, а продукти розщеплення виявляються гетерогенними, що ускладнює їх використання в генетичній інженерії.
Рестриктази типу II складаються з двох субодиниць одного виду, мають масу епімолекули близько 100 кДа і потребують здійснення нуклеазної активності тільки в іонах Mg 2+ (метилази цієї системи є самостійними ферментами).
Рестриктази цього типу впізнають у ДНК послідовності з 4-8 нуклеотидів, що мають вісь симетрії другого порядку (паліндроми).
Вони гідролізують фосфодіефірні зв'язки у двох ланцюгах ДНК, здійснюючи або симетричні або несиметричні розриви в зоні паліндрому. У першому випадку утворюються так звані «тупі кінці»:
У другому випадку дія рестриктаз призводить до утворення ДНК так званих «липких кінців»:
Висока специфічність дії, що призводить до утворення певних ділянок (сайтів) рестрикції, визначила підвищений інтерес до рестриктазів типу II, які стали найважливішим інструментом генетичної інженерії. картування геномів по різних сайтах рестрикції, а також вищеплювати певні ділянки, розташовані між цими сайтами (рестрикційні фрагменти), і далі комбінувати ці ділянки, призвело до того, що число відомих рестриктаз типу II стало швидко наростати. , то до 1995 р. стало відомо 2400 рестриктаз цього типу, що мають 188 специфічних сайтів рестрикції. із шимешеразами. Нижче наведено назви деяких широко використовуваних рестриктаз та позначення відповідних сайтів естрикції:
Останнім часом серед рестриктаз типу II відкриті ферменти, що розпізнають непаліндромні структури та розщеплюють ДНК на суворо фіксованій відстані від ділянки впізнавання з утворенням як тупих, так і «липких кінців». shift — перестановка, зрушення).З них особливо цікаві ті, які утворюють досить довгі «липкі кінці». У кожному місці гідролізу досліджуваної молекули ДНК такі «липкі кінці» мають унікальнупослідовність. , як, наприклад, це було зроблено щодо фага fl з використанням рестрик-тази Нра I. Ще один фермент цього підкласу ВЪі 1 (з Bacillus brevis) - дізнається в ДНК послідовність, що має структуру
і розщеплює ДНК по одному з ланцюгів на відстані 8 нуклеотидів від сайту впізнавання, а по іншому ланцюгу - на відстані 12 нуклеотидів від ділянки, що впізнається.
Рестриктази типу III подібні до ферментів типу I. Для прояву активності вони потребують ATP, Mg 2+ і S-аденозилметіоніну. Ці рестриктази складаються з 2 типів субодиниць (рестриктази та метілази). Вони впізнають непаліндромні послідовності завдовжки 5-6 н. п. і розщеплюють ДНК осторонь сайтів впізнавання з відривом 24—25 зв. п. Вичерпного гідролізу ДНК вони не виробляють.
Крім бактерій рестриктази виявлено у дріжджів Sachramyces serevisiae та одноклітинних водоростей Chlamydomonas reinhardtii і за властивостями нагадують рестриктази типу ІІІ. У водоростей рестриктаза Cre I виявлена лише у зиготах і активна щодо лише хлоропластичної ДНК одного з партнерів. У генетичній інженерії рестриктази (особливо типу II) використовують для отримання бібліотек, або банків геномної ДНК При обробці хромосомної ДНК рестриктазами (метод дробовика "shotgun") отримують величезну кількість фрагментів ДНК (10 5 -10 7 фрагментів з геному ссавців). Далі шляхом використання плазмід та їх клонування (див. нижче) отримують мільйони колоній клітин бактерій або дріжджів, кожна з яких містить плазміду з різними фрагментами ДНК. Це і є бібліотека, чи банк геномної ДНК. Відповідний банк використали і щодо структури геному людини.
З огляду на високу специфічність рестриктаз до певної послідовності ДНК з роздільною здатністю до 1 н. п. вони широко застосовуються для виявлення наявності чи відсутності сайтів рестрикції у певній послідовності ДНК.Найчастіше це стосується структури генів, які можуть мати мутації, що збігаються за послідовністю нуклеотидів з сайтом ретрикції будь-якої з відомих рестриктаз. Дикий тип такого гена рестрикції не піддається, а мутантний розщеплюється на фрагменти певної довжини. Ці рестрикційні фрагменти візуалізують методами електрофорезу або ДНК-ДНК гібридизації (нижче). За наявності у досліджуваного організму відразу кількох мутацій або в загальному сенсі — алелей гена, специфічних для однієї і тієї ж рестриктази, вони виявляються одночасно і формують на електрофореграмі сукупність рестрикційних фрагментів, що утворюють свого роду відбиток пальця організму, що дозволяє диференціювати окремі індивідууми чи їх характерні ознаки, звані молекулярні ключі, які використовують, наприклад, для систематики рослин та тварин, ідентифікації штамів бактерій та ін. Практикум».
